Η βασική διαφορά μεταξύ του CRISPR και των περιοριστικών ενζύμων είναι ότι το CRISPR είναι ένας φυσικά προκαρυωτικός αμυντικός μηχανισμός του ανοσοποιητικού συστήματος που έχει χρησιμοποιηθεί πρόσφατα για επεξεργασία και τροποποίηση ευκαρυωτικών γονιδίων, ενώ τα περιοριστικά ένζυμα είναι βιολογικά ψαλίδια που διασπούν τα μόρια DNA σε μικρότερες ουσίες.
Η επεξεργασία του γονιδιώματος και η γονιδιακή τροποποίηση είναι ενδιαφέροντα και καινοτόμα πεδία στη γενετική και τη μοριακή βιολογία. Οι μελέτες γονιδιακής θεραπείας χρησιμοποιούν ευρέως τη γονιδιακή τροποποίηση. Επιπλέον, η γονιδιακή τροποποίηση είναι χρήσιμη για την αναγνώριση των ιδιοτήτων του γονιδίου, της λειτουργικότητας του γονιδίου και του τρόπου με τον οποίο οι μεταλλάξεις στο γονίδιο θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη λειτουργία του. Είναι σημαντικό να εξαχθούν αποτελεσματικοί και αξιόπιστοι τρόποι για να γίνουν ακριβείς, στοχευμένες αλλαγές στο γονιδίωμα των ζωντανών κυττάρων. Το CRISPR και τα περιοριστικά ένζυμα παίζουν βασικό ρόλο στις γονιδιακές τροποποιήσεις. Το CRISPR τροποποιεί τα γονίδια με υψηλή ακρίβεια. Τα περιοριστικά ένζυμα λειτουργούν ως βιολογικά ψαλίδια που διασπούν τα μόρια του DNA σε μικρότερες ουσίες.
Τι είναι το CRISPR;
Το σύστημα CRISPR είναι ένας φυσικός μηχανισμός που υπάρχει σε ορισμένα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των E. coli και Archea. Είναι μια προσαρμοστική ανοσολογική προστασία έναντι εισβολών που βασίζονται σε ξένο DNA. Επιπλέον, είναι ένας μηχανισμός συγκεκριμένης ακολουθίας. Το σύστημα CRISPR περιέχει πολλά στοιχεία επανάληψης DNA. Αυτά τα στοιχεία είναι διάσπαρτα με σύντομες αλληλουχίες «διαστήματος» που προέρχονται από ξένο DNA και πολλαπλά γονίδια Cas. Μερικά από τα γονίδια Cas είναι νουκλεάσες. Έτσι, το πλήρες ανοσοποιητικό σύστημα αναφέρεται ως σύστημα CRISPR/Cas.
Το σύστημα CRISPR/Cas λειτουργεί σε τέσσερα βήματα:
- Το σύστημα που συνδέει γενετικά τμήματα DNA φάγου και πλασμιδίου εισβολής (αποστάτες) στους τόπους CRISPR (ονομάζεται βήμα απόκτησης διαχωριστή).
- βήμα ωρίμανσης crRNA – Ο ξενιστής μεταγράφει και επεξεργάζεται τους τόπους CRISPR για να δημιουργήσει ώριμο CRISPR RNA (crRNA) που περιέχει και τα δύο επαναλαμβανόμενα στοιχεία CRISPR και το ενσωματωμένο στοιχείο διαχωρισμού.
- Το crRNA ανιχνεύει ομόλογες αλληλουχίες DNA με συμπληρωματικό ζεύγος βάσεων. Αυτό είναι σημαντικό όταν υπάρχει λοίμωξη και υπάρχει μολυσματικός παράγοντας.
- Βήμα παρεμβολής στόχου – το crRNA ανιχνεύει ξένο DNA, σχηματίζει σύμπλεγμα με το ξένο DNA και προστατεύει τον ξενιστή από το ξένο DNA.
Προς το παρόν, το σύστημα CRISPR/Cas9 χρησιμοποιείται για την αλλαγή ή την τροποποίηση του γονιδιώματος των θηλαστικών είτε με καταστολή μεταγραφής είτε με ενεργοποίηση. Τα κύτταρα των θηλαστικών μπορούν να ανταποκριθούν σε θραύσματα DNA που προκαλούνται από το CRISPR/Cas9 υιοθετώντας μηχανισμό επιδιόρθωσης. Μπορεί να γίνει είτε με τη μέθοδο μη ομόλογης σύνδεσης άκρου (NHEJ) είτε με επισκευή κατευθυνόμενη από ομολογία (HDR). Και οι δύο αυτοί μηχανισμοί επισκευής πραγματοποιούνται με την εισαγωγή σπασίματος διπλού κλώνου. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την επεξεργασία γονιδίων θηλαστικών. Το NHEJ μπορεί να οδηγήσει σε κατάλυση γονιδιακών μεταλλάξεων και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να δημιουργήσει αποτελέσματα απώλειας λειτουργίας. Το HDR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εισαγωγή συγκεκριμένων σημειακών μεταλλάξεων ή την εισαγωγή τμημάτων DNA διαφορετικού μήκους. Επί του παρόντος, το σύστημα CRISPR/ Cas χρησιμοποιείται στους τομείς των θεραπευτικών, βιοϊατρικών, γεωργικών και ερευνητικών εφαρμογών.
Τι είναι τα ένζυμα περιορισμού;
Ένα ένζυμο περιορισμού, που συνήθως αναφέρεται ως περιοριστική ενδονουκλεάση, έχει την ικανότητα να διασπά μόρια DNA σε μικρά θραύσματα. Η διαδικασία διάσπασης συμβαίνει κοντά ή σε μια ειδική θέση αναγνώρισης του μορίου DNA που ονομάζεται θέση περιορισμού. Μια τοποθεσία αναγνώρισης αποτελείται συνήθως από 4-8 ζεύγη βάσεων. Ανάλογα με τη θέση της διάσπασης, τα ένζυμα περιορισμού μπορεί να είναι τεσσάρων (04) διαφορετικών τύπων: Τύπου Ι, Τύπου II, Τύπου III και Τύπου IV. Εκτός από το σημείο της διάσπασης, παράγοντες όπως η σύνθεση, η απαίτηση για συμπαράγοντες και η κατάσταση της αλληλουχίας στόχου λαμβάνονται υπόψη κατά τη διαφοροποίηση των περιοριστικών ενζύμων σε τέσσερις ομάδες.
Κατά τη διάρκεια της διάσπασης των μορίων DNA, η θέση διάσπασης μπορεί να βρίσκεται είτε στην ίδια τη θέση περιορισμού είτε σε απόσταση από τη θέση περιορισμού. Τα περιοριστικά ένζυμα δημιουργούν δύο τομές μέσω καθεμίας από τη ραχοκοκαλιά σακχάρου-φωσφορικού στη διπλή έλικα του DNA.
Εικόνα 02: Ένζυμα περιορισμού
Τα περιοριστικά ένζυμα βρίσκονται κυρίως στην Αχαΐα και στα βακτήρια. Χρησιμοποιούν αυτά τα ένζυμα ως αμυντικό μηχανισμό ενάντια στους εισβολείς ιούς. Τα περιοριστικά ένζυμα διασπούν το ξένο (παθογόνο) DNA αλλά όχι το δικό τους DNA. Το δικό τους DNA προστατεύεται από ένα ένζυμο γνωστό ως μεθυλοτρανσφεράση, το οποίο κάνει τροποποιήσεις στο DNA του ξενιστή και αποτρέπει τη διάσπαση.
Το περιοριστικό ένζυμο Τύπου Ι διαθέτει μια θέση διάσπασης που βρίσκεται μακριά από τη θέση αναγνώρισης. Η λειτουργία του ενζύμου απαιτεί ATP και την πρωτεΐνη, S-αδενοσυλ-L-μεθειονίνη. Το ένζυμο περιορισμού τύπου Ι θεωρείται ότι είναι πολυλειτουργικό λόγω της παρουσίας τόσο περιοριστικής όσο και μεθυλάσης δραστηριότητας. Τα περιοριστικά ένζυμα τύπου II διασπώνται εντός της ίδιας της θέσης αναγνώρισης ή σε πιο κοντινή απόσταση από αυτήν. Απαιτεί μόνο μαγνήσιο (Mg) για τη λειτουργία του. Τα περιοριστικά ένζυμα τύπου II έχουν μόνο μία λειτουργία και είναι ανεξάρτητα από τη μεθυλάση.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ CRISPR και περιοριστικών ενζύμων;
- CRISPR και τα περιοριστικά ένζυμα είναι σημαντικά εργαλεία στη γονιδιακή τροποποίηση.
- Μέρος του CRISPR ή του Cas9 και τα περιοριστικά ένζυμα είναι οι ενδονουκλεάσες.
- Και οι δύο μπορούν να αναγνωρίσουν χαρακτηριστικές αλληλουχίες DNA και να διασπάσουν το DNA.
- Υπάρχουν σε βακτήρια και αρχαία.
- Τόσο το CRISPR όσο και τα περιοριστικά ένζυμα είναι ειδικά για την αλληλουχία.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ CRISPR και περιοριστικών ενζύμων;
Το σύστημα CRISPR-Cas είναι ένα προκαρυωτικό ανοσοποιητικό σύστημα που προσδίδει αντίσταση σε ξένα γενετικά στοιχεία. Από την άλλη πλευρά, τα ένζυμα περιορισμού είναι ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων και παράγουν μια δίκλωνη τομή στο DNA. Αυτή είναι λοιπόν η βασική διαφορά μεταξύ του CRISPR και των περιοριστικών ενζύμων.
Επιπλέον, το CRISPR- επιτρέπει εξαιρετικά ακριβείς κοπές. Σε σύγκριση με αυτό, η διάσπαση του περιοριστικού ενζύμου είναι λιγότερο ακριβής. Επιπλέον, το CRISPR είναι μια προηγμένη τεχνική ενώ τα περιοριστικά ένζυμα είναι πρωτόγονα.
Το παρακάτω infographic συνοψίζει τη διαφορά μεταξύ CRISPR και περιοριστικών ενζύμων.
Σύνοψη – CRISPR vs περιοριστικά ένζυμα
Το CRISPR και τα περιοριστικά ένζυμα είναι δύο τύποι τεχνικών που χρησιμοποιούνται στη γονιδιακή τροποποίηση. Το CRISPR είναι προσαρμοστική ανοσολογική προστασία που εκτελείται σε ορισμένα βακτήρια έναντι εισβολών που βασίζονται σε ξένο DNA. Είναι ένας φυσικός αμυντικός μηχανισμός. Αντίθετα, τα περιοριστικά ένζυμα είναι ενδονουκλεάσες που διασπούν το δίκλωνο DNA. Τόσο το CRISPR όσο και τα περιοριστικά ένζυμα μπορούν να κόψουν το DNA σε μικρά τμήματα. Ωστόσο, και οι δύο είναι συγκεκριμένες για την αλληλουχία. Σε σύγκριση με το CRISPR, τα ένζυμα περιορισμού είναι πρωτόγονα. Το CRISPR επιτρέπει εξαιρετικά ακριβείς κοπές από τα ένζυμα περιορισμού. Έτσι, αυτή είναι η περίληψη της διαφοράς μεταξύ του CRISPR και των περιοριστικών ενζύμων.
