Βασική διαφορά – SYBR Green εναντίον Taqman
SYBR Green και Taqman είναι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ή την παρακολούθηση της διαδικασίας ενίσχυσης της PCR σε πραγματικό χρόνο. Το SYBR Green είναι μια μέθοδος που βασίζεται σε παρεμβαλλόμενη βαφή χρώσης νουκλεϊκού οξέος ενώ το Taqman είναι μια μέθοδος που βασίζεται σε ανιχνευτή υδρόλυσης. Και οι δύο τεχνολογίες έχουν σχεδιαστεί για να παράγουν φθορισμό κατά τη διάρκεια της PCR, ο οποίος επιτρέπει τη μηχανή PCR σε πραγματικό χρόνο να παρακολουθεί την αντίδραση σε «πραγματικό χρόνο». Η μέθοδος SYBR Green πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας μια φθορίζουσα χρωστική που ονομάζεται SYBR green και ανιχνεύει την ενίσχυση δεσμεύοντας τη χρωστική σε παραγόμενο δίκλωνο DNA. Το Taqman πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ανιχνευτές διπλής επισήμανσης και ανιχνεύει την ενίσχυση με αποικοδόμηση του ανιχνευτή από την πολυμεράση Taq και απελευθερώσεις του φθοροφόρου. Αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ SYBR Green και Taqman.
Τι είναι το SYBR Green;
SYBR Green είναι μια φθορίζουσα χρωστική που χρησιμοποιείται για τη χρώση των νουκλεϊκών οξέων, ειδικά του δίκλωνου DNA στη Μοριακή Βιολογία. Η μέθοδος SYBR Green χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια της PCR σε πραγματικό χρόνο. Μόλις συνδεθεί με το DNA, το σύμπλοκο DNA-χρωστικής που προκύπτει απορροφά το μπλε φως και εκπέμπει έντονο πράσινο φως. Συμβαίνει λόγω της δομικής αλλαγής που συμβαίνει στο μόριο της χρωστικής κατά τη σύνδεση με δίκλωνο DNA. Όταν η PCR δημιουργεί όλο και περισσότερο DNA, περισσότερα μόρια χρωστικής συνδέονται με το DNA, δημιουργώντας περισσότερο φθορισμό. Επομένως, ο φθορισμός αυξάνεται με τη συσσώρευση του προϊόντος PCR. Ως εκ τούτου, η ποσότητα του προϊόντος PCR μπορεί να μετρηθεί ποσοτικά με την ανίχνευση φθορισμού SYBR Green.
Η πράσινη βαφή SYBR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για επισήμανση DNA στην κυτταρομετρία και στη μικροσκοπία φθορισμού. Το βρωμιούχο αιθίδιο έχει αντικατασταθεί με επιτυχία από το SYBR Green καθώς το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια καρκινογόνος χρωστική ουσία με προβλήματα απόρριψης κατά την οπτικοποίηση του DNA στην ηλεκτροφόρηση γέλης.
Υπάρχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της πράσινης μεθόδου SYBR. Αυτή η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη, φθηνή και εύκολη στη χρήση. Ωστόσο, λόγω της ικανότητάς του να δεσμεύεται σε οποιοδήποτε δίκλωνο DNA, η μη ειδική δέσμευση μπορεί να οδηγήσει σε υπερβολική ποσοτικοποίηση του προϊόντος PCR.
Εικόνα 01: Πράσινη τεχνική SYBR
Τι είναι το Taqman;
Το Taqman είναι μια εναλλακτική μέθοδος του SYBR Green για την παρακολούθηση της διαδικασίας PCR σε πραγματικό χρόνο. Αυτή η μέθοδος εξαρτάται από τη δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5' – 3' του ενζύμου πολυμεράσης Taq για την αποικοδόμηση των ανιχνευτών κατά την επέκταση του νέου κλώνου και την απελευθέρωση φθοροφόρου. Σε αυτή τη μέθοδο χρησιμοποιούνται ανιχνευτές με διπλή επισήμανση και βασίζεται στην υδρόλυση των ανιχνευτών. Οι ανιχνευτές είναι επισημασμένα με φθορισμό ολιγονουκλεοτίδια DNA που έχουν ένα φθορίζον μόριο αναφοράς (φθοροφόρο) στο 5' άκρο και ένα μόριο σβήσιμο στο 3' άκρο. Έχουν σχεδιαστεί για να συνδέονται με το μονόκλωνο πρότυπο στην αντίθετη πλευρά των ανόπτησης ασταριού. Η πολυμεράση Taq προσθέτει νουκλεοτίδια στον εκκινητή και επεκτείνει τον νέο κλώνο προς τους διπλοσημασμένους ανιχνευτές. Μόλις η πολυμεράση Taq συναντήσει τον ανιχνευτή, η δράση εξωνουκλεάσης της πολυμεράσης Taq ενεργοποιεί και υποβαθμίζει τον ανιχνευτή. Μόλις ολοκληρώσει τη σύνθεση του νέου κλώνου, ο ανιχνευτής υποβάλλεται σε πλήρη αποικοδόμηση και απελευθερώνει το φθοροφόρο. Η απελευθέρωση φθοροφόρου προκαλεί φθορισμό. Το μόριο Fluorescent Quencher σβήνει αποτελεσματικά το εκπεμπόμενο φως και δημιουργεί την έξοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό του προϊόντος PCR. Η απελευθέρωση φθοροφόρων και η ποσότητα των προϊόντων PCR είναι ανάλογες. Ως εκ τούτου, η ποσοτικοποίηση μπορεί να γίνει εύκολα με τη μέθοδο Taqman.
Εικόνα 02: Μέθοδος Taqman
Η μέθοδος Taqman χρησιμοποιείται σε πραγματικό χρόνο PCR, ποσοτικοποίηση γονιδιακής έκφρασης, ανίχνευση γενετικών πολυμορφισμών, ποσοτικοποίηση διαγραφών χρωμοσωμικού DNA, βακτηριακή ταυτοποίηση, επαλήθευση ανάλυσης μικροσυστοιχιών, προσδιορισμός γονότυπου SNP κ.λπ.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ πράσινου SYBR και Taqman;
SYBR Green εναντίον Taqman |
|
| SYBR Green βασίζεται σε βαφή σύνδεσης DNA. | Το Taqman εξαρτάται από τους ανιχνευτές υβριδισμού και τη δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5' έως 3' της πολυμεράσης Taq. |
| Fluorescently Labeled Probes | |
| Δεν απαιτούνται ανιχνευτές με σήμανση φθορισμού. | Απαιτούνται ανιχνευτές με διπλή ετικέτα. |
| Multiplex Gene Analysis | |
| Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολλαπλούς στόχους γονιδίων. | Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για στόχους πολλαπλών γονιδίων. |
| Κόστος | |
| Αυτό είναι λιγότερο ακριβό. | Αυτό είναι πιο ακριβό. |
| Ειδικότητα | |
| Αυτό είναι λιγότερο ειδικό και συνδέεται με οποιοδήποτε DNA διπλής έλικος | Αυτά είναι εξαιρετικά συγκεκριμένα καθώς οι ανιχνευτές ανιχνεύουν τα συγκεκριμένα προϊόντα ενίσχυσης. |
| Αποτελεσματικότητα | |
| Αυτό είναι λιγότερο αποτελεσματικό. | Αυτό είναι πολύ αποτελεσματικό. |
| Αίτηση | |
| Χρησιμοποιείται σε PCR σε πραγματικό χρόνο, οπτικοποίηση γέλης αγαρόζης, επισήμανση DNA κ.λπ. | Χρησιμοποιείται σε πραγματικό χρόνο PCR, ποσοτικοποίηση γονιδιακής έκφρασης, ανίχνευση γενετικών πολυμορφισμών κ.λπ. |
Σύνοψη – SYBR Green and Taqman
Taqman και SYBR green είναι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην PCR πραγματικού χρόνου (ποσοτική PCR). Και οι δύο μέθοδοι επιτρέπουν τον ποσοτικό προσδιορισμό του προϊόντος PCR αποτελεσματικά και βασίζονται στην εκπομπή του φθορισμού. Η μέθοδος Taqman χρησιμοποιεί ανιχνευτές διπλής σήμανσης για την ανίχνευση του συσσωρευμένου DNA ενώ η μέθοδος SYBR Green χρησιμοποιεί μια φθορίζουσα χρωστική ουσία. Και οι δύο αυτές μέθοδοι έχουν επίσης διαφορετικές εφαρμογές στη μοριακή βιολογία.
