Βασική διαφορά – Θερμή έναντι Ψυχρής Τρυψινοποίησης
Η θερμή και η ψυχρή θρυψινοποίηση είναι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην ενζυματική αποσύνθεση των κυττάρων στην καλλιέργεια ζωικών κυττάρων. Η βασική διαφορά μεταξύ θερμής και ψυχρής θρυψίνης, όπως υποδηλώνουν τα ονόματα, εξαρτάται από τη θερμοκρασία στην οποία προστίθεται η θρυψίνη για κυτταρική διάσπαση. Η θερμή θρυψίνη λαμβάνει χώρα σε συνθήκες υψηλότερης θερμοκρασίας (36,5 – 37 0C) ενώ η ψυχρή θρυψίνη λαμβάνει χώρα σε συνθήκες χαμηλής θερμοκρασίας.
Κατά τη διαδικασία της πρωτογενούς κυτταρικής καλλιέργειας ζωικών κυττάρων, τρεις βασικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται και έχουν αποδειχθεί επιτυχείς. Οι τρεις μέθοδοι περιλαμβάνουν τη μηχανική αποσυσσωμάτωση των κυττάρων, την ενζυματική αποσυσσωμάτωση των κυττάρων και την τεχνική του πρωτογενούς εμφυτεύματος. Η ενζυματική αποσύνθεση των κυττάρων οδηγεί στην απομόνωση των κυττάρων και γίνεται από το ένζυμο θρυψίνη που αποικοδομεί τις πρωτεΐνες. Επομένως, αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως Τρυψινοποίηση. Η θρυψίνη μπορεί να γίνει κάτω από δύο διαφορετικές συνθήκες, δηλαδή τη θερμή θρυψίνη και την ψυχρή θρυψίνη. Η θερμή θρυψίνη είναι η μέθοδος επεξεργασίας των κυττάρων με θρυψίνη σε θερμές συνθήκες σε θερμοκρασία 36,5 – 37 0C. Η ψυχρή θρυψίνη είναι η διαδικασία επεξεργασίας με θρυψίνη που λαμβάνει χώρα υπό ψυχρότερες συνθήκες κατά προτίμηση σε πάγο που διατηρούν πολύ χαμηλές θερμοκρασίες.
Τι είναι η θερμή θρυψίνη;
Η θρυψίνη μπορεί να γίνει για τη διάσπαση των κυτταρικών συστατικών προκειμένου να απομονωθούν τα κύτταρα για να παραχθεί μια πρωτογενής κυτταρική καλλιέργεια. Η θρυψίνη είναι ένα ένζυμο αποικοδόμησης πρωτεϊνών και το ενζυμικό μίγμα που χρησιμοποιείται στην θρυψίνη μπορεί να είναι είτε ακατέργαστο εκχύλισμα είτε καθαρισμένο προϊόν. Το ακατέργαστο εκχύλισμα λέγεται ότι είναι πιο αποτελεσματικό στη λύση πρωτεϊνών και την κυτταρική αποσύνθεση καθώς περιέχει άλλα αποικοδομητικά ένζυμα.
Η θερμή θρυψίνη είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη ενζυματική μέθοδος για τη διάσπαση των κυττάρων που λαμβάνει χώρα σε συνθήκες υψηλότερης θερμοκρασίας. Πριν από την επεξεργασία με θρυψίνη, ο επιθυμητός ιστός τεμαχίζεται σε μικρότερα κομμάτια. Διευκολύνει την εύκολη διαδικασία διαχωρισμού. Ο ψιλοκομμένος ιστός στη συνέχεια πλένεται σε ειδικό μέσο γνωστό ως μέσο βασικού άλατος ανατομής.
Με την ολοκλήρωση του σταδίου πλύσης, τα κύτταρα μετασχηματίζονται σε φιάλη που περιέχει το ενεργό ένζυμο, το οποίο είναι η θρυψίνη. Καθώς αυτή η τεχνική συνεπάγεται ένα πρωτόκολλο θερμής θρυψίνης, η θρυψίνη τοποθετείται σε θερμοκρασία περίπου 37 0C για περίπου τέσσερις ώρες.
Εικόνα 01: Τρυψίνη
Τα περιεχόμενα αναμειγνύονται και αναδεύονται χρησιμοποιώντας μεθόδους φυγοκέντρησης για την ευκολία του πρωτοκόλλου και για την επιτάχυνση της διαδικασίας αποσύνθεσης. Μόλις επιτευχθεί ο συνιστώμενος χρόνος, τα κύτταρα μπορούν να προέρχονται από το υπερκείμενο. Τα κύτταρα που προέρχονται από το υπερκείμενο στη συνέχεια επωάζονται σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και χρόνο.
Τι είναι η ψυχρή θρυψίνη;
Η ψυχρή θρυψινοποίηση είναι ο άλλος τύπος θρυψινοποίησης που λαμβάνει χώρα υπό ψυχρές συνθήκες. Σε αυτή την τεχνική, τα κύτταρα που ψιλοκόβονται και πλένονται τοποθετούνται σε φιαλίδια σε πάγο και στη συνέχεια εμποτίζονται με θρυψίνη. Η περίοδος μουλιάσματος είναι πολύ μεγαλύτερη – περίπου 6 – 24 ώρες.
Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας εμποτισμού, η θρυψίνη αφαιρείται από το κυτταρόλυμα και τα κομμάτια ιστού επωάζονται περαιτέρω στους 37 0C για περίπου 20 – 30 λεπτά. Η αποσυσσωμάτωση των κυττάρων επιτυγχάνεται με επαναλαμβανόμενη πιπέταση του μίγματος ιστού. Αυτό θα επιτρέψει στα κύτταρα να αποσυνδεθούν από τη μεμβράνη και να έρθουν στο υπερκείμενο. Μόλις τα κύτταρα βρεθούν στο υπερκείμενο, επωάζονται και αναπτύσσονται σε επιθυμητή θερμοκρασία και χρονική περίοδο.
Η μέθοδος ψυχρής θρυψινοποίησης έχει πολλά πλεονεκτήματα
- Μεγαλύτερη απόδοση βιώσιμων κυττάρων καθώς ελαχιστοποιείται η κυτταρική βλάβη. Η βλάβη των κυττάρων ελαχιστοποιείται με τη μη χρήση βημάτων φυγοκέντρησης.
- Πολύ βολική μέθοδος.
- Λιγότερο κοπιαστικό.
Ο κύριος περιορισμός της μεθόδου ψυχρής θρυψινοποίησης είναι ότι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν μεγάλες ποσότητες σε μία περίπτωση.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ της θερμής και της ψυχρής θρυψίνης;
- Και οι διεργασίες θερμής και ψυχρής θρυψίνης χρησιμοποιούν το ένζυμο θρυψίνη για τη διάσπαση των κυττάρων.
- Τόσο οι διαδικασίες θερμής όσο και ψυχρής θρυψίνης χρησιμοποιούνται σε διαδικασίες κυτταροκαλλιέργειας για τη διάσπαση των κυττάρων.
- Στις διαδικασίες θεραπείας θερμής και ψυχρής θρυψίνης, τα κύτταρα προέρχονται από το υπερκείμενο.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της θερμής και της ψυχρής θρυψίνης;
Θερμή εναντίον Ψυχρής Τρυψινίωση |
|
| Η θερμή θρυψίνη είναι η μέθοδος επεξεργασίας των κυττάρων με θρυψίνη σε θερμές συνθήκες σε θερμοκρασία 36,5 – 37 0. | Η ψυχρή θρυψίνη είναι η διαδικασία επεξεργασίας με θρυψίνη που λαμβάνει χώρα υπό ψυχρότερες συνθήκες, κατά προτίμηση σε πάγο που διατηρούν πολύ χαμηλές θερμοκρασίες. |
| Πρωτόκολλο | |
| Τα κομμένα κομμάτια ιστού διατηρούνται στους 37 0C συνεχώς καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας. | Τα κομμένα κομμάτια ιστού διατηρούνται αρχικά σε παγωμένη θερμοκρασία και στη συνέχεια διατηρούνται στους 37 0. |
| Θερμοκρασία | |
| Η θερμή θρυψινοποίηση εμφανίζεται στους 36,5 – 37 0 | Η ψυχρή θρυψίνη λαμβάνει χώρα σε παγωμένες θερμοκρασίες. |
| Χρόνος που καταναλώθηκε | |
| Λιγότερος χρόνος που απαιτείται για ολόκληρη τη διαδικασία (περίπου 4 ώρες) θερμής θρυψίνης. | Απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος (περίπου 6 – 24 ώρες) για ψυχρή θρυψίνη. |
| Απόδοση βιώσιμων κυττάρων | |
| Χαμηλή θερμή θρυψινοποίηση. | Υψηλή σε ψυχρή θρυψίνη. |
| Χρήση φυγοκέντρησης | |
| Απαιτείται φυγοκέντρηση για τη διάσπαση των κυττάρων στη θερμή θρυψίνη. | Δεν απαιτείται φυγοκέντρηση σε ψυχρή θρυψίνη. |
| Αρχική ποσότητα ιστού για θρυψίνη | |
| Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μεγαλύτερη ποσότητα ιστού στη θερμή θρυψίνη. | Μικρότερη ποσότητα ιστού μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ψυχρή θρυψινοποίηση. |
| Κυτταρική βλάβη | |
| Υψηλό λόγω φυγοκέντρησης σε θερμή θρυψίνη. | Λιγότερο λόγω ψυχρής θρυψινοποίησης. |
Σύνοψη – Θερμή έναντι Ψυχρής Τρυψινοποίησης
Η θρυψίνη είναι η μέθοδος χρήσης του ενζύμου αποικοδόμησης πρωτεϊνών θρυψίνη για τη διάσπαση και την παρασκευή πρωτογενών κυτταροκαλλιεργειών κατά τη διάρκεια της διαδικασίας κυτταροκαλλιέργειας. Υπάρχουν δύο κύριες τεχνικές τρυψινοποίησης με βάση τις θερμοκρασίες που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Είναι θερμή και ψυχρή θρυψίνη. Η θερμή θρυψίνη πραγματοποιείται στους 37 0C ενώ η ψυχρή θρυψίνη πραγματοποιείται υπό συνθήκες παγωμένου κρύου. Αν και η ψυχρή θρυψίνη χρειάζεται περισσότερο χρόνο για να ολοκληρωθεί, λέγεται ότι έχει υψηλότερη απόδοση βιώσιμων κυττάρων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η κυτταρική βλάβη ελαχιστοποιείται στην ψυχρή θρυψινοποίηση καθώς δεν χρησιμοποιεί έντονα βήματα φυγοκέντρησης. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ θερμής και ψυχρής θρυψίνης.
