Βασική διαφορά – Μικροσυστοιχία έναντι αλληλουχίας RNA
Το Transcriptome αντιπροσωπεύει ολόκληρο το περιεχόμενο του RNA που υπάρχει σε ένα κύτταρο συμπεριλαμβανομένων των mRNA, rRNA, tRNA, αποικοδομημένο RNA και, μη αποικοδομημένο RNA. Το προφίλ του μεταγραφώματος είναι μια σημαντική διαδικασία για την κατανόηση των πληροφοριών των κυττάρων. Υπάρχουν πολλές προηγμένες μέθοδοι για τη δημιουργία προφίλ μεταγραφής. Η μικροσυστοιχία και η αλληλουχία RNA είναι δύο τύποι τεχνολογιών που αναπτύχθηκαν για την ανάλυση του μεταγραφώματος. Η βασική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας μικροσυστοιχίας και RNA είναι ότι η μικροσυστοιχία βασίζεται στο δυναμικό υβριδισμού προσχεδιασμένων επισημασμένων ανιχνευτών με αλληλουχίες cDNA στόχου ενώ η αλληλουχία RNA βασίζεται στον άμεσο προσδιορισμό αλληλουχίας κλώνων cDNA με προηγμένες τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας όπως το NGS. Η μικροσυστοιχία εκτελείται με την προηγούμενη γνώση για τις αλληλουχίες και η αλληλουχία RNA πραγματοποιείται χωρίς την προηγούμενη γνώση για τις αλληλουχίες.
Τι είναι το Microarray;
Η Μικροσυστοιχία είναι μια στιβαρή, αξιόπιστη και υψηλής απόδοσης μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία προφίλ μεταγραφής από επιστήμονες. Είναι η πιο δημοφιλής προσέγγιση για ανάλυση μεταγραφών. Είναι μια μέθοδος χαμηλού κόστους, η οποία εξαρτάται από τους ανιχνευτές υβριδισμού.
Η τεχνική ξεκινά με εξαγωγή mRNA από το δείγμα και κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA από ολικό RNA. Στη συνέχεια αναμιγνύεται με προσχεδιασμένους ανιχνευτές με φθορίζουσα επισήμανση σε στερεά επιφάνεια (spot matrix). Οι συμπληρωματικές αλληλουχίες υβριδοποιούνται με τους επισημασμένους ανιχνευτές στη μικροσυστοιχία. Στη συνέχεια, η μικροσυστοιχία πλένεται και ελέγχεται, και η εικόνα ποσοτικοποιείται. Τα δεδομένα που συγκεντρώθηκαν πρέπει να αναλυθούν για να ληφθούν τα σχετικά προφίλ έκφρασης.
Η ένταση των ανιχνευτών μικροσυστοιχίας θεωρείται ότι είναι ανάλογη με την ποσότητα των μεταγραφών στο δείγμα. Ωστόσο, η ακρίβεια της τεχνικής εξαρτάται από τους σχεδιασμένους ανιχνευτές, την προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας και τη συγγένεια των ανιχνευτών για υβριδισμό. Ως εκ τούτου, η τεχνολογία μικροσυστοιχιών έχει περιορισμούς. Η τεχνική μικροσυστοιχίας δεν μπορεί να εκτελεστεί με μεταγραφές χαμηλής αφθονίας. Αποτυγχάνει να διαφοροποιήσει τις ισομορφές και να αναγνωρίσει γενετικές παραλλαγές. Δεδομένου ότι αυτή η μέθοδος εξαρτάται από τον υβριδισμό των ανιχνευτών, ορισμένα προβλήματα που σχετίζονται με τον υβριδισμό, όπως ο διασταυρούμενος υβριδισμός, ο μη ειδικός υβριδισμός κ.λπ. εμφανίζονται στην τεχνική της μικροσυστοιχίας.
Εικόνα 01: Μικροσυστοιχία
Τι είναι η αλληλουχία RNA;
Η Η αλληλουχία κυνηγετικού όπλου RNA (RNA seq) είναι μια πρόσφατα αναπτυγμένη τεχνική αλληλουχίας πλήρους μεταγραφώματος. Είναι μια ταχεία και υψηλής απόδοσης μέθοδος δημιουργίας προφίλ μεταγραφής. Προσδιορίζει άμεσα την έκφραση των γονιδίων και οδηγεί σε βαθιά διερεύνηση του μεταγραφώματος. Η αλληλουχία RNA δεν εξαρτάται από προσχεδιασμένους ανιχνευτές ή προηγούμενη γνώση των αλληλουχιών. Επομένως, η μέθοδος RNA seq έχει υψηλή ευαισθησία και ικανότητα ανίχνευσης νέων γονιδίων και γενετικών παραλλαγών.
Η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας RNA πραγματοποιείται μέσω πολλών βημάτων. Το συνολικό RNA του κυττάρου πρέπει να απομονωθεί και να κατακερματιστεί. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση, πρέπει να προετοιμαστεί μια βιβλιοθήκη cDNA. Κάθε κλώνος cDNA πρέπει να συνδέεται με προσαρμογείς. Στη συνέχεια τα συνδεδεμένα θραύσματα πρέπει να ενισχυθούν και να καθαριστούν. Τέλος, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο NGS, πρέπει να γίνει η αλληλουχία του cDNA.
Εικόνα 02: Αλληλουχία RNA
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας μικροσυστοιχιών και του RNA;
Μικροσυστοιχία έναντι αλληλουχίας RNA |
|
| Η μικροσυστοιχία είναι μια ισχυρή, αξιόπιστη μέθοδος υψηλής απόδοσης. | Η αλληλουχία RNA είναι μια ακριβής και υψηλής απόδοσης μέθοδος. |
| Κόστος | |
| Αυτή είναι μια μέθοδος χαμηλού κόστους. | Αυτή είναι μια ακριβή μέθοδος. |
| Ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων | |
| Αυτό διευκολύνει την ταυτόχρονη ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων. | Αυτό διευκολύνει την ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων. |
| Ανάλυση δεδομένων | |
| Η ανάλυση δεδομένων είναι πολύπλοκη. | Δημιουργούνται περισσότερα δεδομένα σε αυτήν τη μέθοδο. ως εκ τούτου, η διαδικασία είναι πιο περίπλοκη. |
| Προηγούμενη γνώση των ακολουθιών | |
| Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε ανιχνευτές υβριδισμού, επομένως απαιτείται προηγούμενη γνώση των αλληλουχιών. | Αυτή η μέθοδος δεν εξαρτάται από την προηγούμενη γνώση της ακολουθίας. |
| Δομικές παραλλαγές και νέα γονίδια | |
| Αυτή η μέθοδος δεν μπορεί να ανιχνεύσει δομικές παραλλαγές και νέα γονίδια. | Αυτή η μέθοδος μπορεί να ανιχνεύσει δομικές παραλλαγές όπως σύντηξη γονιδίων, εναλλακτικό μάτισμα και νέα γονίδια. |
| Ευαισθησία | |
| Αυτό δεν μπορεί να ανιχνεύσει διαφορές στην έκφραση των ισομορφών, επομένως έχει περιορισμένη ευαισθησία. | Αυτό έχει υψηλή ευαισθησία. |
| Αποτέλεσμα | |
| Αυτό μπορεί να οδηγήσει μόνο σε σχετικά επίπεδα έκφρασης. Αυτό δεν δίνει απόλυτη ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης. | Δίνει απόλυτα και σχετικά επίπεδα έκφρασης. |
| Επανανάλυση δεδομένων | |
| Αυτό πρέπει να επαναληφθεί για να αναλυθεί εκ νέου. | Τα δεδομένα αλληλουχίας μπορούν να αναλυθούν εκ νέου. |
| Ανάγκη για συγκεκριμένο προσωπικό και υποδομή | |
| Δεν απαιτούνται ειδικές υποδομές και προσωπικό για μικροσυστοιχίες. | Ειδική υποδομή και προσωπικό που απαιτούνται για την αλληλουχία RNA. |
| Τεχνικά Θέματα | |
| Η τεχνική μικροσυστοιχίας έχει τεχνικά ζητήματα όπως διασταυρούμενο υβριδισμό, μη ειδικό υβριδισμό, περιορισμένο ρυθμό ανίχνευσης μεμονωμένων ανιχνευτών κ.λπ. | Η τεχνική RNA seq αποφεύγει τεχνικά ζητήματα όπως διασταυρούμενο υβριδισμό, μη ειδικό υβριδισμό, περιορισμένο ρυθμό ανίχνευσης μεμονωμένων ανιχνευτών κ.λπ. |
| Προκαταλήψεις | |
| Αυτή είναι μια προκατειλημμένη μέθοδος, καθώς εξαρτάται από τον υβριδισμό. | Η προκατάληψη είναι χαμηλή σε σύγκριση με τη μικροσυστοιχία. |
Σύνοψη – Μικροσυστοιχία έναντι αλληλουχίας RNA
Οι μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας μικροσυστοιχιών και RNA είναι πλατφόρμες υψηλής απόδοσης που αναπτύχθηκαν για τη δημιουργία προφίλ μεταγραφομένων. Και οι δύο μέθοδοι παράγουν αποτελέσματα που συσχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, η αλληλουχία RNA έχει πλεονεκτήματα έναντι της μικροσυστοιχίας για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Η αλληλουχία RNA είναι μια πιο ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση μεταγραφών χαμηλής αφθονίας από τη μικροσυστοιχία. Η αλληλουχία RNA επιτρέπει επίσης τη διαφοροποίηση μεταξύ ισομορφών και την ταυτοποίηση παραλλαγών γονιδίων. Ωστόσο, η μικροσυστοιχία είναι η κοινή επιλογή των περισσότερων ερευνητών, καθώς η αλληλουχία RNA είναι μια νέα και δαπανηρή τεχνική με προκλήσεις αποθήκευσης δεδομένων και πολύπλοκη ανάλυση δεδομένων.
