Η βασική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο και της αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου έγκειται στη μέθοδο συμπεριφοράς τους. Η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας κλώνου με κλώνο περιλαμβάνει χαρτογράφηση χρωμοσωμάτων και κλωνοποίηση πριν από τον προσδιορισμό αλληλουχίας, ενώ η αλληλουχία κλώνων με κυνηγετικό όπλο παραλείπει τόσο τη χαρτογράφηση χρωμοσωμάτων όσο και τα βήματα κλωνοποίησης κατά τη διάρκεια της αλληλουχίας.
Αλληλουχία κλώνου με κλώνο και αλληλούχιση κλώνου με κυνηγετικό όπλο είναι δύο μέθοδοι σύγχρονου προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδιώματος. Η αλληλουχία κλώνου με κλώνο είναι μια πιο αξιόπιστη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας. Ωστόσο, η μέθοδος της κλωνοποίησης με αλληλουχία κυνηγετικού όπλου είναι ταχύτερη και φθηνότερη. Το άρθρο εστιάζει στη λεπτή διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο και της αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου.
Τι είναι Clone by Clone Sequencing;
Ο προσδιορισμός αλληλουχίας κλώνου με κλώνο είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδιώματος. Απαιτεί τη χαρτογράφηση κάθε χρωμοσώματος πριν από τη διάσπαση του DNA. Μετά τη χαρτογράφηση, το DNA θα πρέπει να διασπαστεί σε θραύσματα μήκους 150 kilobases. Αυτά τα θραύσματα είναι στη συνέχεια έτοιμα για αλληλούχιση. Το επόμενο βήμα είναι η εισαγωγή θραυσμάτων DNA σε βακτηριακά τεχνητά χρωμοσώματα (BACs) και στη συνέχεια σε βακτηριακά κύτταρα. Δεδομένου ότι τα θραύσματα βρίσκονται τώρα μέσα στα βακτηριακά κύτταρα, κάθε φορά που τα βακτήρια διαιρούνται, τα παρεμβαλλόμενα θραύσματα DNA διαιρούνται επίσης και παράγουν πολλά πανομοιότυπα αντίγραφα. Στη συνέχεια, το μεμονωμένο βακτηριακό κλώνο DNA κατακερματίζεται σε θραύσματα μήκους 500 ζευγών βάσεων. Είναι μικρότερα και αλληλοκαλυπτόμενα θραύσματα. Στη συνέχεια, η αλληλούχιση λαμβάνει χώρα με την εισαγωγή αυτών των θραυσμάτων σε έναν φορέα με γνωστή αλληλουχία DNA. Ξεκινώντας από τη γνωστή ακολουθία του διανύσματος, η αλληλουχία συνεχίζεται μέχρι την άγνωστη ακολουθία.
Μετά την ολοκλήρωση της αλληλουχίας, είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν οι περιοχές των αλληλοκαλυπτόμενων ακολουθιών. Στη συνέχεια, η ένωση των θραυσμάτων λαμβάνει χώρα για να σχηματιστούν τα μεγαλύτερα θραύσματα που παρουσιάστηκαν αρχικά στα BAC. Στη συνέχεια, η συναρμολόγηση μεγαλύτερων θραυσμάτων στο χρωμόσωμα πραγματοποιείται σύμφωνα με τον χάρτη του γονιδιώματος.
Εικόνα 01: Κλωνοποίηση με αλληλουχία κλώνων
Το σημαντικό πλεονέκτημα της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο είναι ότι ο προπαρασκευασμένος χάρτης γονιδιώματος βοηθά στην αξιόπιστη συναρμολόγηση μεγαλύτερων θραυσμάτων. Όμως, το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας είναι ότι είναι χρονοβόρα η δημιουργία χαρτών γονιδιώματος και η κατασκευή κλώνων. Ωστόσο, αυτή ήταν η μέθοδος που προτιμήθηκε κατά τη διάρκεια του «Human Genome Project».
Τι είναι το Clone by Shotgun Sequencing;
Η αλληλουχία κλώνου με κυνηγετικό όπλο είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που διασπά τυχαία τις αλληλουχίες DNA σε πολλά μικρά θραύσματα και επανασυναρμολογεί την αλληλουχία παρατηρώντας τις επικαλυπτόμενες περιοχές. Τα μεγαλύτερα γονιδιώματα θηλαστικών είναι δύσκολο να κλωνοποιηθούν και να συναρμολογηθούν. Οφείλεται στη δομική πολυπλοκότητα και το μέγεθός τους. Παρόλο που η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας κλώνου με κλώνο είναι αξιόπιστη, χρειάζεται πολύς χρόνος για την αλληλουχία γονιδιωμάτων πολύπλοκων οργανισμών. Ως εκ τούτου, η αλληλουχία με κλωνοποίηση με κυνηγετικό όπλο έχει γίνει μια αξιόπιστη φθηνότερη μέθοδος αλληλουχίας που μπορεί να εκτελεστεί πιο γρήγορα. Ως εκ τούτου, οι σύγχρονοι επιστήμονες βασίζονται σε αυτή τη μέθοδο αλληλούχισης για την αντιμετώπιση πολύπλοκων γονιδιωμάτων.
Εικόνα 02: Clone by Shotgun Sequencing
Κατά τη διάρκεια της μεθόδου κλωνοποίησης με κυνηγετικό όπλο, δεν πραγματοποιούνται συμβατικά βήματα χαρτογράφησης και κλωνοποίησης γονιδιώματος. Αρχικά, ολόκληρο το γονιδίωμα κατακερματίζεται σε διάφορα μεγέθη από 20 kilobases έως 300 kilobases. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται η αλληλουχία. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας εξελιγμένο λογισμικό υπολογιστή, είναι απαραίτητο να συναρμολογήσετε τα θραύσματα κοιτάζοντας τις επικαλυπτόμενες περιοχές.
Η αλληλουχία του κλώνου με κυνηγετικό όπλο βοηθά στη βελτίωση της ακρίβειας των υπαρχουσών αλληλουχιών γονιδιώματος. Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι είναι πολύ πιο γρήγορη και λιγότερο δαπανηρή από τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας κλώνου με κλώνο. Ωστόσο, αυτή η διαδικασία δεν περιλαμβάνει τη χρήση γενετικού χάρτη. Ως εκ τούτου, είναι πιο πιθανό να εμφανιστούν σφάλματα κατά τη συναρμολόγηση. Έτσι, αυτό είναι ένα σημαντικό μειονέκτημα στη μέθοδο κλωνοποίησης με κυνηγετικό όπλο.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ Clone by Clone Sequencing και Shotgun Sequencing;
- Τόσο η αλληλουχία κλώνου με κλώνο όσο και η αλληλουχία κυνηγετικού όπλου είναι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδιώματος.
- Κατά τη διάρκεια και των δύο τεχνικών αλληλουχίας, η συναρμολόγηση των σπασμένων θραυσμάτων πραγματοποιείται με τον εντοπισμό επικαλυπτόμενων περιοχών.
- Επίσης, η διάσπαση του DNA σε μικρότερα θραύσματα είναι απαραίτητη για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας τόσο του κλώνου όσο και του κυνηγετικού όπλου.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Clone by Clone Sequencing και Shotgun Sequencing;
Η τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας κλώνου με κλώνο περιλαμβάνει δύο βασικά βήματα: χαρτογράφηση χρωμοσωμάτων και κλωνοποίηση. Αντίθετα, η αλληλουχία του κλώνου με κυνηγετικό όπλο δεν ακολουθεί αυτά τα δύο βήματα. Διασπά τυχαία τις αλληλουχίες DNA σε πολλά μικρά θραύσματα και επανασυναρμολογεί την αλληλουχία παρατηρώντας τις επικαλυπτόμενες περιοχές. Ως εκ τούτου, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο και της αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου. Λόγω αυτού του παράγοντα, η αλληλουχία κλώνων με κλώνο είναι μια δαπανηρή και χρονοβόρα διαδικασία, ενώ η αλληλουχία κλώνων με κυνηγετικό όπλο είναι ταχύτερη και φθηνότερη.
Ωστόσο, σφάλματα κατά τη συναρμολόγηση είναι λιγότερο πιθανό να συμβούν κατά τη διάρκεια της αλληλουχίας κλώνου προς κλώνο. Ως εκ τούτου, έχει υψηλή αξιοπιστία. Ωστόσο, η αλληλουχία του κλώνου με κυνηγετικό όπλο είναι συγκριτικά μια λιγότερο αξιόπιστη τεχνική. Έτσι, αυτή είναι επίσης μια σημαντική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο και της αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου.
Το παρακάτω γραφικό πληροφοριών παρουσιάζει περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη διαφορά μεταξύ αλληλουχίας κλώνου ανά κλώνο και αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου.
Σύνοψη – Clone by Clone Sequencing vs Shotgun Sequencing
Συνοψίζοντας τη διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο και της αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου, η αλληλουχία κλώνου με κλώνο και η αλληλουχία κυνηγετικού όπλου είναι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας γονιδιώματος. Ωστόσο, η τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας κλώνου με κλώνο περιλαμβάνει διαδικασίες χαρτογράφησης γονιδιώματος και κλωνοποίησης, ενώ ο προσδιορισμός αλληλουχίας κλώνου με κυνηγετικό όπλο όχι. Έτσι, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο και της αλληλουχίας κυνηγετικού όπλου. Εφόσον η χαρτογράφηση του γονιδιώματος λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της αλληλουχίας κλώνου με κλώνο, είναι λιγότερο πιθανό να εμφανιστούν σφάλματα κατά τη συναρμολόγηση των αλληλουχιών. Όμως, η αλληλουχία του κλώνου με κυνηγετικό όπλο είναι μια πολύ πιο γρήγορη και φθηνότερη διαδικασία. Ωστόσο, είναι συγκριτικά λιγότερο αξιόπιστο. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας κλώνου με κλώνο ήταν η προτιμώμενη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας κατά τη διάρκεια του «Project Human Genome». Όμως, ο σύγχρονος μοριακός βιολόγος βασίζεται περισσότερο στον κλώνο με την αλληλουχία κυνηγετικού όπλου.
