Βασική διαφορά – Επιλέξιμος δείκτης έναντι γονιδίου αναφοράς
Η τεχνική της γενετικής μηχανικής χρησιμοποιείται για τη μεταφορά σημαντικών γονιδίων από οργανισμό σε άλλο οργανισμό. Η εισαγωγή ενός ξένου γονιδίου στο γονιδίωμα ενός άλλου οργανισμού και η έκφρασή του εντός του κυττάρου ξενιστή είναι τα πιο δύσκολα βήματα στη μεταφορά γονιδίων. Για την ανίχνευση της επιτυχίας της διαδικασίας μετασχηματισμού, ένας επιλέξιμος δείκτης και ένα γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιούνται στο ανασυνδυασμένο μόριο. Ένας επιλέξιμος δείκτης είναι μια αλληλουχία DNA ή ένα γονίδιο που εκφράζει και επιλέγει τα μετασχηματισμένα κύτταρα από τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Ένα γονίδιο αναφοράς είναι ένα άλλο γονίδιο που χρησιμοποιείται για τη διάκριση των μετασχηματισμένων κυττάρων και για τον ποσοτικό προσδιορισμό ή την ανίχνευση του τρόπου λειτουργίας του εισαγόμενου γονιδίου εντός του ξενιστή. Η βασική διαφορά μεταξύ του επιλέξιμου δείκτη και του γονιδίου αναφοράς είναι ότι ο επιλέξιμος δείκτης χρησιμοποιείται για τη διαλογή των μη μετασχηματισμένων κυττάρων και για τη σηματοδότηση των μετασχηματισμένων κυττάρων, ενώ το γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό του επιπέδου γονιδιακής έκφρασης εντός του ξενιστή.
Τι είναι ένας επιλέξιμος δείκτης;
Στη γενετική μηχανική, το γονίδιο ενδιαφέροντος εισάγεται σε κατάλληλο φορέα και μετασχηματίζεται σε οργανισμούς ξενιστές. Ωστόσο, ο μετασχηματισμός είναι επιτυχής μόνο στα ικανά κύτταρα-ξενιστές και υπάρχει η πιθανότητα τα κύτταρα-ξενιστές να απορρίψουν την πρόσληψη ξένου DNA. Επομένως, η διαφοροποίηση των μετασχηματισμένων και μη μετασχηματισμένων κυττάρων είναι σημαντική για να συνεχιστεί με περαιτέρω πειραματισμούς. Ως εκ τούτου, οι ερευνητές ενσωματώνουν ένα επιλέξιμο γονίδιο δείκτη σε φορέα για εύκολη επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων από τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Ένας επιλέξιμος δείκτης είναι μια αλληλουχία DNA, ειδικά ένα γονίδιο χρήσιμο στην ταυτοποίηση των μετασχηματισμένων κυττάρων. Αυτό το γονίδιο δείκτη εμφανίζει ένα χαρακτηριστικό που ταιριάζει σε μια τεχνητή επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων από μη μετασχηματισμένα κύτταρα σε ένα μέσο.
Οι πιο κοινοί επιλέξιμοι δείκτες που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία είναι γονίδια ανθεκτικά στα αντιβιοτικά. Ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά εισάγεται στον φορέα και μετασχηματίζεται σε κύτταρα ξενιστές, ειδικά στο βακτήριο ξενιστή. Το συγκεκριμένο αντιβιοτικό ενσωματώνεται στο μέσο ανάπτυξης του βακτηρίου. Λόγω της παρουσίας του επιλεκτικού δείκτη, υπό τις εκλεκτικές συνθήκες, μόνο τα κύτταρα που περιέχουν τον κατάλληλο επιλέξιμο δείκτη μπορούν να επιβιώσουν. Τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα δεν μπορούν να αναπτυχθούν στο μέσο που περιέχει αντιβιοτικό. Επομένως, λόγω του επιλέξιμου δείκτη που είναι ανθεκτικός στα αντιβιοτικά, τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναγνωρίζονται εύκολα.
Γονίδια που προσδίδουν χαρακτηριστικά σε αντιμεταβολίτες, ζιζανιοκτόνα χρησιμοποιούνται ως επιλεκτικοί δείκτες σε φορείς κλωνοποίησης στη γενετική μηχανική των φυτών. Ωστόσο, αυτή η συν-μετατροπή επιλεκτικών δεικτών σε γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς έχει αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον και στον άνθρωπο. Η απελευθέρωση ανθεκτικών στα αντιβιοτικά βακτηρίων μπορεί να αυξήσει την αντίσταση των ανθρώπινων παθογόνων στα αντιβιοτικά. Μπορεί να μολύνει το προϊόν ή τη βιομάζα από αντιβιοτικά και μπορεί να χάσει την επιλεκτική πίεση ως αποτέλεσμα της αποδόμησης και αδρανοποίησης των αντιβιοτικών.
Εικόνα 01: Φορέας πλασμιδίου για μεταφορά γονιδίου με επιλέξιμο δείκτη
Τι είναι το γονίδιο αναφοράς;
Τα γονίδια αναφοράς είναι γονίδια που επιτρέπουν την ανίχνευση ή τη μέτρηση της έκφρασης γονιδίου που έχει εισαχθεί. Αυτά τα γονίδια αναφοράς μπορούν να προσαρτηθούν σε ρυθμιστικές αλληλουχίες του γονιδίου που ενδιαφέρει για να σηματοδοτήσουν τη θέση ή τα επίπεδα έκφρασης. Επομένως, κατά τη διάρκεια της έκφρασης γονιδίων κάτω από τον ίδιο προαγωγέα, μεταγράφονται σε μια μοναδική αλληλουχία mRNA και στη συνέχεια μεταφράζονται σε μια πρωτεΐνη που μπορεί να υποδεικνύει το επίπεδο γονιδιακής έκφρασης.
Τα γονίδια αναφοράς είναι διαφόρων τύπων και περιέχουν οπτικά αναγνωρίσιμα χαρακτηριστικά που συνήθως εμπλέκονται σε φθορίζουσες και φωταυγείς πρωτεΐνες. Γονίδια που κωδικοποιούν φθορίζουσες πρωτεΐνες και ένζυμα, μετατρέπουν αόρατα υποστρώματα σε φωσφορίζοντα ή έγχρωμα προϊόντα σηματοδοτώντας την επιτυχή γονιδιακή έκφραση και δίνοντας την ευκαιρία για ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης.
Εικόνα 02: Έκφραση γονιδίου αναφοράς
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ του Επιλεγμένου δείκτη και του γονιδίου αναφοράς;
Επιλέξιμος δείκτης έναντι γονιδίου αναφοράς |
|
| Επιλέξιμος δείκτης είναι ένα είδος αλληλουχίας DNA που βοηθά στη διάκριση μετασχηματισμένων κυττάρων από μη μετασχηματισμένα κύτταρα. | Το γονίδιο αναφοράς είναι ένα γονίδιο που βοηθά στον ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης του επιθυμητού γονιδίου που εισάγεται στο κύτταρο ξενιστή. |
| Φύση των μονάδων που παράγονται | |
| Τα γονίδια κωδικοποιούνται με χαρακτηριστικά που βοηθούν στην τεχνητή επιλογή σε καλλιεργητικά μέσα. | Τα γονίδια κωδικοποιούνται με οπτικά αναγνωρίσιμα χαρακτηριστικά. |
| Usage | |
| Γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά, γονίδια αντιμεταβολιτών, γονίδια ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα κ.λπ. είναι παραδείγματα για επιλέξιμο δείκτη. | Γονίδια κώδικα για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, β-γλυκουρονιδάση, ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφενικόλης, κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη κ.λπ. είναι παραδείγματα. |
Σύνοψη – Επιλέξιμος δείκτης έναντι γονιδίου αναφοράς
Επιλέξιμοι δείκτες επιτρέπουν στα μετασχηματισμένα κύτταρα να αναπτυχθούν σε επιλεκτικά μέσα με δόση συγκεκριμένου αντιβιοτικού ή ζιζανιοκτόνου. Χρησιμοποιούνται για την πρώιμη επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων. Τα γονίδια αναφοράς χρησιμοποιούνται για να ποσοτικοποιήσουν το επίπεδο έκφρασης του επιθυμητού γονιδίου που εισάγεται. Επιτρέπουν επίσης τη διαφοροποίηση μετασχηματισμένων και μη μετασχηματισμένων κυττάρων. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ του επιλέξιμου δείκτη και του γονιδίου αναφοράς. Τόσο ο επιλέξιμος δείκτης όσο και το γονίδιο αναφοράς θεωρούνται σημαντικοί δείκτες στη γενετική μηχανική.
