Βασική διαφορά – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Τα νουκλεοτίδια είναι οι βασικές δομικές μονάδες και οι δομικές μονάδες του DNA. Το μόριο DNA αποτελείται από μια πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα. Υπάρχουν τέσσερα διαφορετικά νουκλεοτίδια που βρίσκονται στο DNA. Αυτά τα νουκλεοτίδια αποτελούνται από τέσσερις διαφορετικές αζωτούχες βάσεις που ονομάζονται Α (αδενίνη), G (γουανίνη), C (κυτοσίνη), Τ (θυμίνη). Η σειρά των νουκλεοτιδίων στο μόριο του DNA έχει μεγάλη σημασία καθώς κωδικοποιεί μια σημαντική γενετική πληροφορία για την ανάπτυξη και την ανάπτυξη των οργανισμών. Η αλληλουχία DNA αναφέρεται στη διαδικασία που καθορίζει την ακριβή αλληλουχία νουκλεοτιδίων του DNA. Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Maxam Gilbert και ο προσδιορισμός αλληλουχίας DNA Sanger είναι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που ανήκουν στον προσδιορισμό αλληλουχίας πρώτης γενιάς. Η διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας Maxam Gilbert προσδιορίζει την αλληλουχία βάσης διασπώντας χημικά τα σημασμένα με άκρα 5' θραύσματα DNA κατά προτίμηση σε καθένα από τα τέσσερα νουκλεοτίδια και ηλεκτροφόρηση γέλης. Η διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger προσδιορίζει την αλληλουχία νουκλεοτιδίων συνθέτοντας μονόκλωνο DNA χρησιμοποιώντας πολυμεράση DNA και διδεοξυνουκλεοτίδια και ηλεκτροφόρηση γέλης. Αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ του Maxam Gilbert και του Sanger Sequencing.
Τι είναι η αλληλουχία Maxam Gilbert;
Η αλληλούχιση Maxam Gilbert, γνωστή και ως μέθοδος χημικής αλληλούχισης, είναι μια τεχνική που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό της σειράς των νουκλεοτιδίων στο DNA. Αυτή η μέθοδος εισήχθη από τους W alter Gilbert και Alan Maxam το 1976 και έγινε δημοφιλής αφού μπορεί να πραγματοποιηθεί απευθείας με καθαρισμένο DNA. Η μέθοδος Maxam Gilbert ανήκει στην πρώτη γενιά προσδιορισμού αλληλουχίας DNA και ήταν η πρώτη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που χρησιμοποιήθηκε ευρέως από τους επιστήμονες.
Η βασική αρχή αυτής της μεθόδου έγκειται στον περιορισμό των σημασμένων στο άκρο θραυσμάτων DNA σε συγκεκριμένες βάσεις από χημικές ουσίες και συνθήκες ειδικές για βάση και τον διαχωρισμό των επισημασμένων θραυσμάτων με ηλεκτροφόρηση όπως φαίνεται στο σχήμα 01. Τα θραύσματα διαχωρίζονται σύμφωνα με στα μεγέθη τους στο τζελ. Δεδομένου ότι τα θραύσματα είναι επισημασμένα, η αλληλουχία του μορίου DNA μπορεί εύκολα να συναχθεί.
Η μέθοδος Maxam gilbert χρησιμοποιεί χημικές ουσίες ειδικές για βάση για να σπάσει το DNA σε συγκεκριμένες βάσεις. Δύο κοινές χημικές ουσίες που ονομάζονται θειικός διμεθυλεστέρας και χημικές ουσίες υδραζίνης χρησιμοποιούνται για την επιλεκτική επίθεση στις πουρίνες και τις πυριμιδίνες, αντίστοιχα.
Η μέθοδος αλληλουχίας Maxam Gilbert εκτελείται με διάφορα βήματα ως εξής.
- Καθαρισμός της αλληλουχίας DNA με χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών
- Σήμανση των άκρων των θραυσμάτων DNA με προσθήκη ραδιενεργών φωσφορικών αλάτων
- Καθαρισμός των επισημασμένων θραυσμάτων από μη επισημασμένα θραύσματα με ηλεκτροφόρηση γέλης
- Διαχωρισμός του επισημασμένου στο άκρο DNA σε τέσσερις σωλήνες και επεξεργασία με χημικά ειδικά για βάση ξεχωριστά
- Ηλεκτροφόρηση των περιεχομένων κάθε σωλήνα σε ξεχωριστές γραμμές σε γέλη και διαχωρισμός θραυσμάτων ανάλογα με το μήκος τους.
- Ανίχνευση των θραυσμάτων με αυτοραδιογραφία.
Εικόνα 01: Maxam Gilbert Sequencing
Τι είναι το Sanger Sequencing;
Η αλληλουχία Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τους συνεργάτες του το 1977 για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας βάσης ενός δεδομένου θραύσματος DNA. Είναι επίσης γνωστή ως μέθοδος αλληλουχίας τερματισμού αλυσίδας ή μέθοδος αλληλουχίας διδεοξυ. Αυτή η μέθοδος λειτουργεί με βάση την αρχή της επιλεκτικής ενσωμάτωσης διδεοξυνουκλεοτιδίων τερματισμού αλυσίδας (ddNTPs) όπως ddGTP, ddCTP, ddATP και ddTTP από την DNA πολυμεράση κατά τη διάρκεια της σύνθεσης μονόκλωνου DNA για τον τερματισμό του σχηματισμού κλώνου. Τα διδεοξυνουκλεοτίδια στερούνται 3' ΟΗ ομάδων για το σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών με γειτονικά νουκλεοτίδια. Ως εκ τούτου, ο σχηματισμός κλώνου σταματά όταν ένα ddNTP ενσωματωθεί σε νεοσχηματιζόμενο κλώνο κατά τη διάρκεια της αλληλουχίας του sanger.
Σε αυτή τη μέθοδο, πραγματοποιούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις σύνθεσης DNA (PCR) σε τέσσερις ξεχωριστούς σωλήνες με έναν τύπο ddNTP. Παρέχονται επίσης άλλες απαιτήσεις για τους σωλήνες για PCR, συμπεριλαμβανομένων εκκινητών, dNTPs, Taq πολυμεράσης, ειδικών συνθηκών, κ.λπ. Εκτελούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις σε τέσσερις σωλήνες με τέσσερα μείγματα. Μετά από αντιδράσεις PCR, τα προκύπτοντα θραύσματα DNA μετουσιώνονται θερμικά και διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Στη συνέχεια, τα θραύσματα οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας είτε έναν επισημασμένο (ραδιενεργό ή φθορίζοντα) εκκινητή είτε dNTPs όπως φαίνεται στο σχήμα 02.
Εικόνα 02: Αλληλουχία Sanger
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger Sequencing;
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Maxam Gilbert είναι η πρώτη τεχνική που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA. | Η μέθοδος αλληλούχισης Sanger εισήχθη μετά τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας Maxam Gilbert. |
| Usage | |
| Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται σπάνια. | Η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιείται συνήθως για την αλληλουχία. |
| Χρήση επικίνδυνων χημικών ουσιών | |
| Χρησιμοποιεί επικίνδυνες χημικές ουσίες. | Η χρήση επικίνδυνων χημικών ουσιών είναι περιορισμένη σε σύγκριση με τη μέθοδο Maxam Gilbert. |
| Ετικέτα για ανίχνευση | |
| Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί ραδιενεργό P32 για την επισήμανση των άκρων των θραυσμάτων DNA. | Η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιεί ραδιενεργά ή φθορισμού επισημασμένα ddNTPs. |
Σύνοψη – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Maxam Gilbert και Sanger είναι δύο τύποι τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που υπάγονται στον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA πρώτης γενιάς. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Maxam Gilbert είναι η πρώτη μέθοδος που εισήχθη για τον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA το 1976 και εκτελείται με θραύση των σημασμένων στο άκρο θραυσμάτων DNA με χημικά ειδικά για βάση. Ως εκ τούτου, είναι γνωστό ως χημική αλληλουχία. Η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger εισήχθη το 1977 και βασίζεται στις αντιδράσεις τερματισμού της αλυσίδας που οδηγούνται από ddNTP. Μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger δημοφιλής από τη μέθοδο Maxam Gilbert λόγω πολλών μειονεκτημάτων της μεθόδου Maxam Gilbert όπως η υπερβολική κατανάλωση χρόνου, η χρήση επικίνδυνων χημικών ουσιών κ.λπ. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger sequencing.
