Βασική διαφορά – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Η Η αλληλουχία DNA είναι πολύ σημαντική για την ανάλυση DNA, καθώς η γνώση της σωστής διάταξης νουκλεοτιδίων σε μια συγκεκριμένη περιοχή DNA αποκαλύπτει πολλές σημαντικές πληροφορίες για αυτήν. Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Η αλληλουχία Sanger και η Pyrosequencing είναι δύο διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που χρησιμοποιούνται ευρέως στη Μοριακή Βιολογία. Η βασική διαφορά μεταξύ αλληλουχίας Sanger και Pyrosequencing είναι ότι η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιεί διδεοξυνουκλεοτίδια για να τερματίσει τη σύνθεση του DNA για την ανάγνωση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, ενώ η πυροαλληλουχία ανιχνεύει την απελευθέρωση πυροφωσφορικού ενσωματώνοντας τα νουκλεοτίδια και συνθέτοντας τη συμπληρωματική σειρά της ακριβούς αλληλουχίας για την ανάγνωση της αλληλουχίας.
Τι είναι το Sanger Sequencing;
Η αλληλουχία Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA πρώτης γενιάς που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τα κολέγιά του το 1977. Είναι επίσης γνωστή ως Αλληλουχία Τερματισμού Αλυσίδων ή Αλληλουχία Διδεοξυ, καθώς βασίζεται στον τερματισμό της αλυσίδας με διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs). Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε ευρέως για περισσότερα από 30 χρόνια έως ότου αναπτύχθηκε το New Generation Sequencing (NGS). Η τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger επέτρεψε την ανακάλυψη της σωστής σειράς νουκλεοτιδίων ή την προσκόλληση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Βασίζεται στην επιλεκτική ενσωμάτωση των ddNTPs και στον τερματισμό της σύνθεσης του DNA κατά την in vitro αντιγραφή του DNA. Η απουσία ομάδων 3' ΟΗ για να συνεχιστεί ο σχηματισμός φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ γειτονικών νουκλεοτιδίων είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό των ddNTP. Ως εκ τούτου, μόλις συνδεθεί το ddNTP, η επιμήκυνση της αλυσίδας σταματά και τελειώνει από αυτό το σημείο. Υπάρχουν τέσσερα ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP και ddTTP – που χρησιμοποιούνται στην αλληλουχία Sanger. Αυτά τα νουκλεοτίδια σταματούν τη διαδικασία αντιγραφής του DNA όταν ενσωματώνονται στον αναπτυσσόμενο κλώνο του DNA και καταλήγουν σε ποικίλα μήκη μικρού DNA. Η ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς πηκτής χρησιμοποιείται για την οργάνωση αυτών των κοντών κλώνων DNA με βάση τα μεγέθη τους σε ένα πήκτωμα όπως φαίνεται στο σχήμα 01.
Εικόνα 1: Ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς γέλης συντιθέμενου βραχύ DNA
Για την in vitro αντιγραφή του DNA, θα πρέπει να παρέχονται λίγες απαιτήσεις. Είναι ένζυμο πολυμεράσης DNA, DNA εκμαγείου, ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές και δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs). Στην αλληλουχία Sanger, η αντιγραφή του DNA εκτελείται σε τέσσερις ξεχωριστούς δοκιμαστικούς σωλήνες μαζί με τέσσερις τύπους ddNTP χωριστά. Τα δεοξυνουκλεοτίδια δεν αντικαθίστανται πλήρως από τα αντίστοιχα ddNTP. Ένα μείγμα του συγκεκριμένου dNTP (για παράδειγμα, dATP + ddATP) περιλαμβάνεται στο σωληνάριο και αντιγράφεται. Τέσσερα ξεχωριστά προϊόντα σωλήνων τρέχουν σε ένα τζελ σε τέσσερα χωριστά φρεάτια. Στη συνέχεια, διαβάζοντας το πήκτωμα, η αλληλουχία μπορεί να κατασκευαστεί όπως φαίνεται στο Σχήμα 02.
Εικόνα 02: Αλληλουχία Sanger
Η αλληλούχιση Sanger είναι μια σημαντική τεχνική που βοηθά σε πολλούς τομείς της μοριακής βιολογίας. Το έργο ανθρώπινου γονιδιώματος ολοκληρώθηκε με επιτυχία με τη βοήθεια μεθόδων που βασίζονται στην αλληλουχία Sanger. Η αλληλουχία Sanger είναι επίσης χρήσιμη στον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA-στόχων, στην έρευνα για τον καρκίνο και τις γενετικές ασθένειες, την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, την ταυτοποίηση του ανθρώπου, την ανίχνευση παθογόνων, τον προσδιορισμό της μικροβιακής αλληλουχίας κ.λπ.
Υπάρχουν πολλά μειονεκτήματα της αλληλουχίας Sanger:
- Το μήκος του DNA που αναλύεται δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερο από 1000 ζεύγη βάσεων
- Μπορεί να προσδιοριστεί η αλληλουχία μόνο ενός σκέλους τη φορά.
- Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και δαπανηρή.
Ως εκ τούτου, νέες προηγμένες τεχνικές αλληλούχισης αναπτύχθηκαν με τον καιρό για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα. Ωστόσο, η αλληλουχία Sanger εξακολουθεί να χρησιμοποιείται λόγω των εξαιρετικά ακριβών αποτελεσμάτων της έως και περίπου 850 θραύσματα μήκους ζευγών βάσεων.
Τι είναι η Pyrosequencing;
Η Η πυροσυσταλοποίηση είναι μια νέα τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην «αλληλουχία με σύνθεση». Αυτή η τεχνική βασίζεται στην ανίχνευση της απελευθέρωσης πυροφωσφορικού κατά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίου. Η διαδικασία χρησιμοποιείται από τέσσερα διαφορετικά ένζυμα: πολυμερή DNA, σουλφουρυλάση ATP, λουσιφεράση και απυράση και δύο υποστρώματα φωσφοθειική αδενοσίνη 5' (APS) και λουσιφερίνη.
Η διαδικασία ξεκινά με τη σύνδεση του εκκινητή με το μονόκλωνο εκμαγείο DNA και η DNA πολυμεράση ξεκινά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων συμπληρωματικών προς αυτό. Όταν τα νουκλεοτίδια ενώνονται μεταξύ τους (πολυμερισμός νουκλεϊκού οξέος), απελευθερώνει πυροφωσφορικές (δύο φωσφορικές ομάδες συνδεδεμένες μεταξύ τους) ομάδες και ενέργεια. Κάθε προσθήκη νουκλεοτιδίου απελευθερώνει ισομοριακή ποσότητα πυροφωσφορικού. Το πυροφωσφορικό μετατρέπεται σε ATP από την ATP σουλφουρυλάση παρουσία υποστρώματος APS. Το παραγόμενο ATP οδηγεί τη μεσολαβούμενη από τη λουσιφεράση μετατροπή της λουσιφερίνης σε οξυλουσιφερίνη, παράγοντας ορατό φως σε ποσότητες που είναι ανάλογες με την ποσότητα των ATP. Το φως ανιχνεύεται από μια συσκευή ανίχνευσης φωτονίων ή από φωτοπολλαπλασιαστή και δημιουργεί ένα πυρόγραμμα. Η απυράση αποικοδομεί το ATP και τα μη ενσωματωμένα dNTP στο μίγμα της αντίδρασης. Η προσθήκη dNTP γίνεται μια φορά τη φορά. Εφόσον η προσθήκη νουκλεοτιδίου είναι γνωστή σύμφωνα με την ενσωμάτωση και την ανίχνευση φωτός, η αλληλουχία του εκμαγείου μπορεί να προσδιοριστεί. Το πυρόγραμμα χρησιμοποιείται για τη δημιουργία της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του δείγματος DNA όπως φαίνεται στην Εικόνα 03.
Ο προσδιορισμός πυροσύνθεσης είναι πολύ σημαντικός στην ανάλυση πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου και στον προσδιορισμό της αλληλουχίας μικρών τμημάτων του DNA. Η υψηλή ακρίβεια, η ευελιξία, η ευκολία αυτοματισμού και η παράλληλη επεξεργασία είναι τα πλεονεκτήματα του pyrosequencing έναντι των τεχνικών αλληλουχίας Sanger.
Εικόνα 03: Pyrosequencing
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Sanger Sequencing και Pyrosequencing;
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Η αλληλούχιση Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην επιλεκτική ενσωμάτωση των ddNTPs με πολυμεράση DNA και τον τερματισμό της αλυσίδας. | Ο προσδιορισμός αλληλουχίας πυροσύνθεσης είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην ανίχνευση της απελευθέρωσης πυροφωσφορικού κατά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίου. |
| Χρήση ddNTP | |
| Τα ddNTP χρησιμοποιούνται για τον τερματισμό της αντιγραφής του DNA | ddNTP δεν χρησιμοποιούνται. |
| Ένζυμα που εμπλέκονται | |
| Χρησιμοποιείται DNA πολυμεράση. | Χρησιμοποιούνται τέσσερα ένζυμα: πολυμεράση DNA, σουλφουρυλάση ATP, λουσιφεράση και απυράση. |
| Υποστρώματα που χρησιμοποιούνται | |
| APS και Luciferin δεν χρησιμοποιούνται. | Χρησιμοποιούνται 5' φωσφοθειική αδενοσίνη (APS) και λουσιφερίνη. |
| Μέγιστη θερμοκρασία | |
| Αυτή είναι μια αργή διαδικασία. | Αυτή είναι μια γρήγορη διαδικασία. |
Σύνοψη – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Η αλληλούχιση Sanger και η Pyrosequencing είναι δύο μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία. Η αλληλουχία Sanger κατασκευάζει τη σειρά των νουκλεοτιδίων στην αλληλουχία τερματίζοντας την επιμήκυνση της αλυσίδας, ενώ η πυροσυστοιχία κατασκευάζει την ακριβή σειρά των νουκλεοτιδίων στην αλληλουχία με ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων και ανίχνευση της απελευθέρωσης πυροφωσφορικών. Ως εκ τούτου, η κύρια διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και της Pyrosequencing είναι ότι η αλληλουχία Sanger λειτουργεί στον προσδιορισμό αλληλουχίας με τερματισμό αλυσίδας ενώ η πυροαλληλουχία λειτουργεί στον προσδιορισμό αλληλουχίας με σύνθεση.
