Βασική διαφορά – NGS vs Sanger Sequencing
Η αλληλουχία επόμενης γενιάς (NGS) και η αλληλουχία Sanger είναι δύο τύποι τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας νουκλεοτιδίων που αναπτύχθηκαν με την πάροδο του χρόνου. Η μέθοδος Sanger Sequencing χρησιμοποιήθηκε ευρέως για πολλά χρόνια και η NGS την αντικατέστησε πρόσφατα λόγω των πλεονεκτημάτων της. Η βασική διαφορά μεταξύ NGS και Sanger Sequencing είναι ότι το NGS λειτουργεί με βάση την αρχή της ταυτόχρονης αλληλουχίας εκατομμυρίων αλληλουχιών με γρήγορο τρόπο μέσω ενός συστήματος αλληλούχισης ενώ το Sanger Sequencing λειτουργεί στην αρχή του τερματισμού της αλυσίδας λόγω της επιλεκτικής ενσωμάτωσης διδεοξυνουκλεοτιδίων από το ένζυμο πολυμεράσης DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA και του προκύπτοντος διαχωρισμού θραυσμάτων με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση.
Τι είναι η αλληλουχία νουκλεοτιδίων;
Οι γενετικές πληροφορίες αποθηκεύονται στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του DNA ή του RNA ενός οργανισμού. Η διαδικασία προσδιορισμού της σωστής σειράς νουκλεοτιδίων (χρησιμοποιώντας τέσσερις βάσεις) σε ένα δεδομένο θραύσμα (σε ένα γονίδιο, ένα σύμπλεγμα γονιδίων, το χρωμόσωμα και το πλήρες γονιδίωμα) είναι γνωστή ως αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Είναι πολύ σημαντικό σε γονιδιωματικές μελέτες, εγκληματολογικές μελέτες, ιολογία, βιολογική συστηματική, ιατρική διάγνωση, βιοτεχνολογία και σε πολλούς άλλους τομείς να αναλύεται η δομή και η λειτουργία των γονιδίων. Υπάρχουν διάφοροι τύποι μεθόδων αλληλούχισης που αναπτύχθηκαν από επιστήμονες. Μεταξύ αυτών, η αλληλουχία Sanger που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger το 1977 χρησιμοποιήθηκε ευρέως και διαδόθηκε ευρέως για μεγάλο χρονικό διάστημα έως ότου το αντικατέστησε το Next Generation Sequencing.
Τι είναι το NGS;
Η αλληλουχία επόμενης γενιάς (NGS) είναι ένας όρος που χρησιμοποιείται για να αναφέρεται σε σύγχρονες διαδικασίες αλληλουχίας υψηλής απόδοσης. Περιγράφει μια σειρά από διαφορετικές σύγχρονες τεχνολογίες αλληλούχισης που έφεραν επανάσταση στις γονιδιωματικές μελέτες και τη Μοριακή Βιολογία. Αυτές οι τεχνικές είναι η αλληλουχία Illumina, η αλληλουχία Roche 454, η αλληλουχία ιόντων πρωτονίων και η αλληλουχία SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Τα συστήματα NGS είναι πιο γρήγορα και φθηνότερα. Τέσσερις κύριες μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA χρησιμοποιούνται σε συστήματα NGS και συγκεκριμένα. pyrosequencing, προσδιορισμός αλληλουχίας με σύνθεση, προσδιορισμός αλληλουχίας με σύνδεση και προσδιορισμός αλληλουχίας ιόντων ημιαγωγών. Ένας μεγάλος αριθμός κλώνων DNA ή RNA (εκατομμύρια) μπορεί να αναλυθεί παράλληλα. Επιτρέπει τον προσδιορισμό της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος των οργανισμών σε σύντομο χρονικό διάστημα, σε αντίθεση με την αλληλουχία Sanger που απαιτεί περισσότερο χρόνο.
Το NGS έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη συμβατική μέθοδο Sanger αλληλουχίας. Είναι μια διαδικασία υψηλής ταχύτητας, πιο ακριβής και οικονομικά αποδοτική που μπορεί να εκτελεστεί με ένα μικρό μέγεθος δείγματος. Το NGS μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεταγονιδιωματικές μελέτες, στην ανίχνευση παραλλαγών σε ένα μεμονωμένο γονιδίωμα λόγω εισαγωγών και διαγραφών κ.λπ. και στην ανάλυση γονιδιακών εκφράσεων.
Εικόνα_1: Εξελίξεις στην αλληλουχία NGS
Τι είναι το Sanger Sequencing;
Η αλληλουχία Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τους συνεργάτες του το 1977 για να προσδιοριστεί η ακριβής σειρά νουκλεοτιδίων ενός δεδομένου θραύσματος DNA. Είναι επίσης γνωστό ως αλληλουχία τερματισμού αλυσίδας ή αλληλουχία διδεοξυ. Η αρχή λειτουργίας αυτής της μεθόδου είναι ο τερματισμός της σύνθεσης κλώνου με επιλεκτική ενσωμάτωση διδεοξυνουκλεοτιδίων τερματισμού αλυσίδας (ddNTPs) όπως ddGTP, ddCTP, ddATP και ddTTP από πολυμεράση DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA. Τα κανονικά νουκλεοτίδια έχουν ομάδες 3' ΟΗ για το σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ γειτονικών νουκλεοτιδίων για να συνεχιστεί ο σχηματισμός κλώνου. Ωστόσο, τα ddNTP στερούνται αυτής της ομάδας 3' ΟΗ και δεν είναι σε θέση να σχηματίσουν φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μεταξύ των νουκλεοτιδίων. Ως εκ τούτου, η επιμήκυνση της αλυσίδας σταματά.
Σε αυτή τη μέθοδο, το μονόκλωνο DNA που πρόκειται να προσδιοριστεί η αλληλουχία χρησιμεύει ως ο κλώνος για την in vitro σύνθεση DNA. Άλλες απαιτήσεις είναι ο ολιγονουκλεοτιδικός εκκινητής, οι πρόδρομοι δεοξυνουκλεοτιδικοί και το ένζυμο πολυμεράσης DNA. Όταν είναι γνωστά τα πλευρικά άκρα του θραύσματος στόχου, μπορούν εύκολα να σχεδιαστούν εκκινητές για αντιγραφή DNA. Εκτελούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις σύνθεσης DNA σε τέσσερις ξεχωριστούς σωλήνες. Κάθε σωλήνας έχει ξεχωριστά ddNTP, μαζί με άλλες απαιτήσεις. Από το συγκεκριμένο νουκλεοτίδιο, προστίθεται ένα μείγμα dNTPs και ddNTPs. Ομοίως, πραγματοποιούνται τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις σε τέσσερις σωλήνες με τέσσερα μείγματα. Μετά τις αντιδράσεις, πραγματοποιείται η ανίχνευση θραυσμάτων DNA και η μετατροπή του προτύπου θραύσματος σε πληροφορίες αλληλουχίας. Τα προκύπτοντα θραύσματα DNA μετουσιώνονται θερμικά και διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Εάν χρησιμοποιούνται ραδιενεργά νουκλεοτίδια, το σχέδιο ζωνών στο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου μπορεί να απεικονιστεί με αυτοραδιογραφία. Όταν αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί τα διδεοξυνουκλεοτίδια που έχουν επισημανθεί με φθορισμό, μπορεί να μετριαστεί κατά την ανάγνωση της γέλης και να περάσει μέσα από μια δέσμη λέιζερ για να ανιχνευθεί από τον ανιχνευτή φθορισμού. Για να αποφευχθούν σφάλματα που μπορεί να προκύψουν όταν μια ακολουθία διαβάζεται με το μάτι και εισάγεται χειροκίνητα σε έναν υπολογιστή, αυτή η μέθοδος εξελίχθηκε στη χρήση αυτοματοποιημένου sequencer σε συνδυασμό με τον υπολογιστή.
Αυτή είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την αλληλουχία του DNA από το έργο του ανθρώπινου γονιδιώματος. Αυτή η μέθοδος εξακολουθεί να χρησιμοποιείται με προηγμένες τροποποιήσεις, επειδή παρέχει ακριβείς πληροφορίες ακολουθίας παρόλο που είναι μια δαπανηρή και αργή διαδικασία.
Figure_2: Sanger Sequencing
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ NGS και Sanger Sequencing;
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Η Αλληλουχία Επόμενης Γενιάς (NGS) αναφέρεται στις σύγχρονες διαδικασίες αλληλουχίας υψηλής απόδοσης. Περιγράφει μια σειρά από διαφορετικές σύγχρονες τεχνολογίες αλληλουχίας | Η αλληλούχιση Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger για τον προσδιορισμό της ακριβούς σειράς νουκλεοτιδίων ενός δεδομένου θραύσματος DNA. |
| Κόστος Αποτελεσματικότητα | |
| Το NGS είναι μια φθηνότερη διαδικασία επειδή μειώνει τον χρόνο, την ανθρώπινη δύναμη και τις χημικές ουσίες. | Αυτή είναι μια δαπανηρή διαδικασία επειδή απαιτεί χρόνο, ανθρώπινη δύναμη και περισσότερες χημικές ουσίες. |
| Ταχύτητα | |
| Αυτό είναι πιο γρήγορο αφού τόσο η χημική ανίχνευση όσο και η ανίχνευση σήματος πολλών κλώνων γίνονται παράλληλα. | Αυτό είναι χρονοβόρο, καθώς η χημική ανίχνευση και η ανίχνευση σήματος γίνονται ως δύο ξεχωριστές διεργασίες και μόνο στο σκέλος μπορούν να διαβάσουν τη φορά. |
| Αξιοπιστία | |
| Το NGS είναι αξιόπιστο. | Η αλληλουχία Sanger είναι λιγότερο αξιόπιστη |
| Μέγεθος δείγματος | |
| Το NGS απαιτεί λιγότερη ποσότητα DNA. | Αυτή η μέθοδος χρειάζεται μεγάλη ποσότητα DNA προτύπου. |
| Βάσεις DNA ανά θραύσμα αλληλουχίας | |
| Ο αριθμός των βάσεων DNA ανά θραύσμα αλληλουχίας είναι μικρότερος από τη μέθοδο Sanger | Οι ακολουθίες δημιουργίας είναι μεγαλύτερες από τις ακολουθίες NGS. |
Σύνοψη – NGS vs Sanger Sequencing
Το NGS και το Sanger Sequencing είναι τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας νουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται ευρέως στη Μοριακή Βιολογία. Η αλληλουχία Sanger είναι μια πρώιμη μέθοδος αλληλούχισης που αντικαταστάθηκε από το NGS. Η κύρια διαφορά μεταξύ NGS και Sanger Sequencing είναι ότι το NGS είναι μια διαδικασία υψηλής ταχύτητας, πιο ακριβής και οικονομικά αποδοτική από την αλληλουχία Sanger. Και οι δύο τεχνικές δημιούργησαν μεγάλα ξεσπάσματα στη Γενετική και τη Βιοτεχνολογία.
