Βασική διαφορά – RT PCR έναντι QPCR
Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης περιοχής του DNA in vitro. Λόγω της εφεύρεσης αυτής της τεχνικής από τον Kary Mullis το 1983, οι επιστήμονες είναι σε θέση να δημιουργήσουν χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA για ερευνητικούς σκοπούς. Επί του παρόντος, έχει γίνει μια κοινή και τακτικά εκτελούμενη τεχνική σε κλινικά και ερευνητικά εργαστήρια για μια ευρεία ποικιλία εφαρμογών. Υπάρχουν παραλλαγές της παραδοσιακής τεχνικής PCR όπως RT PCR, ένθετη PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, κ.λπ. Η RT PCR και η Q PCR είναι δύο σημαντικές παραλλαγές της PCR. Η βασική διαφορά μεταξύ RT PCR και Q PCR είναι ότι η RT PCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης μέσω της δημιουργίας μεταγραφών συμπληρωματικού DNA (cDNA) από RNA ενώ η Q PCR χρησιμοποιείται για την ποσοτική μέτρηση των προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας φθορίζουσες βαφές.
Τι είναι η RT PCR;
Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT PCR) είναι μια παραλλαγή της PCR που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της έκφρασης RNA. Είναι μια πολύ σημαντική μέθοδος για την ανίχνευση της έκφρασης mRNA στους ιστούς. Η RT PCR χρησιμοποιείται όταν το αρχικό υλικό του δείγματος είναι RNA. Στην RT PCR, το εκμαγείο mRNA μετατρέπεται πρώτα σε συμπληρωματικό DNA. Αυτό το στάδιο καταλύεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση και η διαδικασία είναι γνωστή ως αντίστροφη μεταγραφή. Δεύτερον, η παραδοσιακή PCR χρησιμοποιείται για το πρόσφατα συντιθέμενο cDNA για την ενίσχυση.
Η RT PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική που απαιτεί σχετικά μικρή ποσότητα δείγματος RNA. Η RT PCR χρησιμοποιείται συνήθως για τη διάγνωση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ειδών RNA, ειδικά των ιών RNA όπως ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας και ο ιός της ηπατίτιδας C.
Εικόνα 01: Τεχνική RT PCR
Τι είναι το QPCR;
Η Quantitative PCR (QPCR) είναι μια παραλλαγή της PCR που χρησιμοποιείται για την ποσοτική μέτρηση των προϊόντων PCR. Αναφέρεται επίσης ως αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, καθώς μετρά την ενίσχυση σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας μηχανή PCR σε πραγματικό χρόνο. Είναι μια κατάλληλη μέθοδος για τον προσδιορισμό της ποσότητας μιας αλληλουχίας στόχου ή γονιδίου που υπάρχει σε ένα δείγμα. Το ενδιαφέρον χαρακτηριστικό του QPCR είναι ότι συνδυάζει τόσο την ενίσχυση όσο και την πραγματική ποσοτικοποίηση σε ένα μόνο βήμα. Επομένως, η ανάγκη για ηλεκτροφόρηση γέλης στην ανίχνευση μπορεί να εξαλειφθεί με την τεχνική QPCR. Το QPCR χρησιμοποιεί φθορίζουσες βαφές για την επισήμανση προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια των αντιδράσεων PCR, οι οποίες τελικά οδηγούν σε άμεση ποσοτικοποίηση. Όταν συσσωρεύονται τα προϊόντα PCR, συσσωρεύονται και τα φθορίζοντα σήματα και θα μετρηθεί από τη μηχανή πραγματικού χρόνου. Το QPCR μπορεί να συνδυαστεί με RT PCR. Είναι γνωστό ως RT – QPCR ή QRT – PCR και θεωρείται ως η πιο ισχυρή, ευαίσθητη και ποσοτική μέθοδος για την ανίχνευση των επιπέδων RNA στα κύτταρα ή τους ιστούς.
SYBR Green και Taqman είναι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ή την παρακολούθηση της διαδικασίας ενίσχυσης της PCR σε πραγματικό χρόνο. Η μέθοδος SYBR Green πραγματοποιείται με τη χρήση μιας φθορίζουσας χρωστικής που ονομάζεται SYBR green και ανιχνεύει την ενίσχυση δεσμεύοντας τη βαφή για την παραγωγή δίκλωνου DNA. Το Taqman πραγματοποιείται με χρήση ανιχνευτών διπλής επισήμανσης και ανιχνεύει την ενίσχυση με αποικοδόμηση του ανιχνευτή από την πολυμεράση Taq και τις απελευθερώσεις του φθοροφόρου όπως φαίνεται στο σχήμα 02. Και οι δύο μέθοδοι παρακολουθούν την πρόοδο της διαδικασίας ενίσχυσης και αναφέρουν την ποσότητα του προϊόντος σε πραγματικό χρόνο.
Η PCR σε πραγματικό χρόνο έχει μεγάλη ποικιλία εφαρμογών, όπως ποσοτικοποίηση γονιδιακής έκφρασης, ανάλυση microRNA και μη κωδικοποιημένου RNA, γονότυπο SNP, ανίχνευση παραλλαγών αριθμού αντιγράφων, ανίχνευση σπάνιων μεταλλάξεων, ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών, ανίχνευση μολυσματικών παραγόντων, κ.λπ.
Εικόνα 02: Ποσοτική τεχνική PCR
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ RT PCR και QPCR;
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης με ενίσχυση. | QPCR είναι μια τεχνική που ενισχύει το DNA και ποσοτικοποιεί τα προϊόντα PCR σε πραγματικό χρόνο. |
| Εμπλοκή του ενζύμου ανάστροφης μεταγραφάσης | |
| Ενζυμική ανάστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται για RT PCR. | Η ενζυμική ανάστροφη μεταγραφάση δεν χρησιμοποιείται για QPCR. |
| Χρήση μορίων με σήμανση φθορισμού | |
| Οι βαφές ή οι ανιχνευτές με σήμανση φθορισμού δεν χρησιμοποιούνται για RT PCR. | χρωστικές ή ανιχνευτές με σήμανση φθορισμού χρησιμοποιούνται για QPCR. |
| Ποσοτικοποίηση προϊόντος PCR | |
| Εκτός εάν συνδυαστεί με QPCR, η RT PCR δεν ποσοτικοποιεί το προϊόν PCR. | QPCR μετρήστε ποσοτικά το προϊόν PCR. |
| Αρχικό Υλικό | |
| Αρχικό υλικό είναι το mRNA. | Αρχικό υλικό είναι το DNA. |
| Σύνθεση cDNA | |
| Συμπληρωματικό DNA παράγεται κατά τη διάρκεια της RT PCR. | Συμπληρωματικό DNA δεν παράγεται κατά την QPCR. |
Σύνοψη – RT PCR vs QPCR
Η RT PCR και QPCR είναι δύο εκδόσεις της παραδοσιακής PCR. Η τεχνική RT PCR εκτελείται για δείγματα mRNA και καθοδηγείται από αντίστροφη μεταγραφή και παραγωγή cDNA. Το QPCR χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια των θερμικών κύκλων PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας φθορίζουσες βαφές ή επισημασμένους ανιχνευτές. Στην QPCR, η ποσότητα του προϊόντος PCR αντιπροσωπεύεται από τα εκπεμπόμενα σήματα φθορισμού από το δείγμα. Η RT PCR χρησιμοποιείται ευρέως ως διαδικασία ενίσχυσης ενώ η QPCR χρησιμοποιείται συνήθως ως διαδικασία ποσοτικοποίησης. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ RT PCR και QPCR.
