PCR έναντι PCR πραγματικού χρόνου
Η PCR ή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια επανάσταση στην ανακάλυψη της σύγχρονης μοριακής βιολογίας, η οποία αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον χημικό Kary Mullis το 1983. Επιτρέπει την ενίσχυση μιας μεμονωμένης αλληλουχίας σε ένα σύνθετο DNA για ανάλυση. Η βασική ιδέα της PCR είναι ότι δύο εκκινητές, οι οποίοι είναι συμπληρωματικοί προς τους αντίθετους κλώνους μιας αλληλουχίας DNA, είναι προσανατολισμένοι ο ένας προς τον άλλο. οι εκκινητές παράγουν συμπληρωματικούς κλώνους, ο καθένας από τους οποίους περιέχει τον άλλο εκκινητή. Ως εκ τούτου, το αποτέλεσμα είναι μια μεγάλη ποσότητα μιας αλληλουχίας που αντιστοιχεί στο DNA που βρίσκεται μεταξύ των δύο εκκινητών. Το ένζυμο πολυμεράσης DNA χρησιμοποιείται για την επέκταση των εκκινητών στην PCR. Η DNA πολυμεράση είναι ένα θερμοσταθερό ένζυμο και έχει την ικανότητα να επιβιώνει σε υψηλές θερμοκρασίες (94 έως 95 °C) που χρησιμοποιείται για τη μετουσίωση του προτύπου DNA.
Η PCR περιλαμβάνει τρία στάδια, συγκεκριμένα, επαναλαμβανόμενους γύρους μετουσίωσης, ανόπτηση εκκινητών και σύνθεση DNA. Για την εκτέλεση αυτής της αντίδρασης χρησιμοποιείται ένα μηχάνημα θερμοκυκλωτή, ώστε να μπορεί να προγραμματιστεί να αλλάζει τις θερμοκρασίες γρήγορα και με ακρίβεια. Οι εφαρμογές της PCR είναι ποινικές έρευνες, δακτυλικό αποτύπωμα DNA, ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών και ανάλυση DNA πρώιμου ανθρώπινου είδους.
Τι είναι η συμβατική PCR;
Υπάρχουν τρία κύρια στάδια της συμβατικής PCR, συγκεκριμένα. Στάδιο ενίσχυσης DNA, διαχωρισμός PCR και ανίχνευση προϊόντων. Ο διαχωρισμός των τμημάτων DNA γίνεται τυπικά με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης. Τα προϊόντα στη συνέχεια χρωματίζονται με βρωμιούχο αιθειδουίμ. Τέλος, η ανίχνευση επιτυγχάνεται με οπτικοποίηση ταινιών σε πηκτώματα υπό υπεριώδες φως. Επομένως, τα τελικά αποτελέσματα της συμβατικής PCR δεν εκφράζονται ως αριθμοί. Κανονικά η συμβατική PCR μπορεί να ανιχνεύσει μόνο μία παράμετρο.
Τι είναι η PCR σε πραγματικό χρόνο;
Η PCR σε πραγματικό χρόνο μπορεί να ανιχνεύσει την ενίσχυση των προϊόντων, καθώς τα προϊόντα συντίθενται. Με την ανάπτυξη της τεχνολογίας, η PCR έχει γίνει μια πολύ δημοφιλής τεχνική, ειδικά για την ανίχνευση και αναγνώριση βακτηρίων στα τρόφιμα. Η PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιεί σύστημα φθορίζουσας βαφής και θερμοκυκλωτή εξοπλισμένο με ικανότητα ανίχνευσης φθορισμού.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της συμβατικής PCR και της PCR πραγματικού χρόνου;
• Η συμβατική PCR είναι πιο χρονοβόρα καθώς χρησιμοποιεί ηλεκτροφόρηση γέλης για την ανάλυση των ενισχυμένων προϊόντων PCR. Αντίθετα, η PCR σε πραγματικό χρόνο είναι λιγότερο χρονοβόρα καθώς μπορεί να ανιχνεύσει ενισχύσεις κατά τις πρώιμες φάσεις της αντίδρασης.
• Η PCR πραγματικού χρόνου συλλέγει δεδομένα στην εκθετική φάση ανάπτυξης της PCR ενώ η παραδοσιακή PCR συλλέγει δεδομένα στο τελικό σημείο της αντίδρασης.
• Τα αποτελέσματα του τελικού σημείου της συμβατικής PCR μπορεί να μην είναι πολύ ακριβή, αλλά τα αποτελέσματα της PCR σε πραγματικό χρόνο είναι πολύ ακριβή.
• Η PCR σε πραγματικό χρόνο είναι πιο ευαίσθητη από τη συμβατική PCR.
• Η συμβατική PCR έχει πολύ κακή ανάλυση, ενώ η PCR σε πραγματικό χρόνο μπορεί να ανιχνεύσει πολύ μικρές αλλαγές λόγω της υψηλής ανάλυσης.
• Η ανίχνευση τελικού σημείου της συμβατικής PCR έχει μικρή δυναμική περιοχή ενώ η ανίχνευση PCR σε πραγματικό χρόνο έχει μεγάλο δυναμικό εύρος.
• Σε αντίθεση με τη συμβατική PCR, οι τεχνικές αυτοματοποιημένης ανίχνευσης βρίσκονται στην PCR σε πραγματικό χρόνο.
• Η συμβατική PCR είναι πολύ εξελιγμένη και εντάσεως εργασίας περισσότερο από την PCR σε πραγματικό χρόνο.
• Σε αντίθεση με την PCR πραγματικού χρόνου, η συμβατική PCR δεν μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ νεκρών και ζωντανών βακτηρίων.
• Η PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιεί σύστημα φθορίζουσας βαφής για την ανίχνευση των προϊόντων, ενώ η συμβατική PCR χρησιμοποιεί βρωμιούχο αιθίδιο και υπεριώδη ακτινοβολία για να απεικονίσει τις ζώνες στο μέσο γέλης αγαρόζης.
