Η βασική διαφορά μεταξύ των συμβατικών δοκιμασιών PCR σε ένθετο και σε πραγματικό χρόνο είναι ότι η συμβατική PCR είναι μια τεχνική που αναπτύχθηκε για την ενίσχυση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA και η ένθετη PCR είναι μια τροποποίηση της συμβατικής PCR που αποτελείται από δύο διαδοχικές αντιδράσεις ενίσχυσης, ενώ η πραγματική -time PCR είναι μια παραλλαγή της συμβατικής PCR που μπορεί να ποσοτικοποιήσει το ενισχυμένο προϊόν.
Η PCR είναι μια πολύ κοινή επιστημονική τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα και την ιατρική για την ανίχνευση του DNA. Οι δοκιμές PCR χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αντιγόνων ανιχνεύοντας το DNA ή το RNA τους. Γενικά, το ιικό RNA υπάρχει στο σώμα πριν ανιχνευθούν αντισώματα ή εμφανιστούν τα συμπτώματα της νόσου. Μια δοκιμή PCR μπορεί να πει εάν κάποιος έχει τον ιό ή όχι από νωρίς. Επί του παρόντος, η PCR είναι η τυπική εξέταση για την ανίχνευση της νόσου COVID-19. Υπάρχουν διάφοροι τύποι τεχνικών PCR όπως PCR πραγματικού χρόνου, ένθετη PCR, multiplex PCR, hot start PCR και PCR μεγάλης εμβέλειας, κ.λπ.
Τι είναι οι συμβατικές αναλύσεις PCR;
Ο συμβατικός προσδιορισμός PCR είναι μια in vitro τεχνική ενίσχυσης DNA που εκτελείται συνήθως σε εργαστήρια μοριακής βιολογικής φύσης. Αυτή η μέθοδος επέτρεψε την παραγωγή χιλιάδων έως εκατομμυρίων αντιγράφων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Ο Kary Mullis εισήγαγε αυτήν την τεχνική το 1980. Αυτή η τεχνική απαιτεί ένα θραύσμα DNA που είναι γνωστό ως πρότυπο προκειμένου να γίνουν πολλά αντίγραφά του. Η πολυμεράση Taq λειτουργεί ως ένζυμο πολυμεράσης DNA και καταλύει τη σύνθεση νέων κλώνων της αλληλουχίας προτύπου.
Primers στο μίγμα PCR θα λειτουργήσουν ως σημεία εκκίνησης για τις επεκτάσεις θραυσμάτων. Όλα τα συστατικά που είναι απαραίτητα για τη δημιουργία αντιγράφων του DNA περιλαμβάνονται στο μείγμα PCR. Η αντίδραση PCR εκτελείται σε μηχανή PCR και θα πρέπει να τροφοδοτηθεί με το σωστό μείγμα PCR και το σωστό πρόγραμμα PCR. Εάν το μείγμα αντίδρασης και το πρόγραμμα είναι σωστά, θα παράγει τον απαιτούμενο αριθμό αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA από μια πολύ μικρή ποσότητα DNA.
Εικόνα 01: Συμβατική ανάλυση PCR
Υπάρχουν τρία κύρια στάδια που εμπλέκονται σε μια αντίδραση PCR: μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητών και επέκταση κλώνου. Αυτά τα τρία βήματα συμβαίνουν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. Το ρυθμιστικό PCR διατηρεί τις βέλτιστες συνθήκες για τη δράση της πολυμεράσης Taq. Αυτά τα τρία στάδια αντίδρασης PCR επαναλαμβάνονται για να παραχθεί η απαιτούμενη ποσότητα του προϊόντος PCR. Σε κάθε αντίδραση PCR, ο αριθμός των αντιγράφων DNA διπλασιάζεται. Ως εκ τούτου, η εκθετική ενίσχυση μπορεί να παρατηρηθεί στην PCR. Το προϊόν PCR μπορεί να αναλυθεί χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης, καθώς παράγει ορατή ποσότητα DNA σε ένα πήκτωμα και μπορεί να καθαριστεί για περαιτέρω μελέτες, όπως η αλληλούχιση.
Η PCR είναι ένα πολύτιμο εργαλείο στην ιατρική και βιολογική έρευνα. Ειδικά στις εγκληματολογικές μελέτες, η PCR έχει τεράστια αξία αφού μπορεί να ενισχύσει το DNA για μελέτες από τα μικροσκοπικά δείγματα των εγκληματιών και να δημιουργήσει ιατροδικαστικά προφίλ DNA. Η PCR χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς τομείς της μοριακής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένου του γονότυπου, της κλωνοποίησης γονιδίων, της ανίχνευσης μεταλλάξεων, του προσδιορισμού αλληλουχίας DNA, των μικροσυστοιχιών DNA και του τεστ πατρότητας.
Τι είναι οι Nested PCR Assays;
Η Nested PCR είναι ένας τύπος PCR που μειώνει τη μη ειδική ενίσχυση του DNA. Υπάρχουν δύο διαδοχικές PCR ή δύο διαδοχικές αντιδράσεις ενίσχυσης στη δοκιμασία ένθετης PCR. Κατά την πρώτη αντίδραση ενίσχυσης, παράγεται ένα προϊόν PCR. Μετά την πρώτη αντίδραση, πραγματοποιείται μια δεύτερη αντίδραση ενίσχυσης στο προϊόν PCR της πρώτης αντίδρασης. Επομένως, οι εκκινητές στο δεύτερο μείγμα αντίδρασης συνδέονται με το πρώτο προϊόν PCR και το ενισχύουν.
Εικόνα 02: Ένθετη PCR
Τα ζεύγη εκκινητών είναι διαφορετικά σε κάθε αντίδραση. Η μη ειδική δέσμευση των εκκινητών μειώνεται σε ένθετη PCR. Οι δοκιμές Nested PCR είναι χρήσιμες για την αύξηση της ευαισθησίας και/ή της ειδικότητας. Ωστόσο, η ένθετη PCR απαιτεί γνώση σχετικά με την ενδιαφέρουσα αλληλουχία.
Τι είναι οι αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο;
Η PCR πραγματικού χρόνου ή η ποσοτική PCR (Q PCR) είναι μια τροποποιημένη έκδοση της PCR που μετρά τα προϊόντα PCR ποσοτικά. Επομένως, αυτή η τεχνική ποσοτικοποιεί την ενίσχυση σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας μια μηχανή PCR πραγματικού χρόνου. Είναι επίσης μια κατάλληλη μέθοδος για τον προσδιορισμό της ποσότητας μιας αλληλουχίας στόχου ή γονιδίου που υπάρχει σε ένα δείγμα.
Το ενδιαφέρον χαρακτηριστικό της PCR σε πραγματικό χρόνο είναι ότι συνδυάζει τόσο την ενίσχυση όσο και την πραγματική ποσοτικοποίηση σε ένα μόνο βήμα. Επομένως, η ανάγκη για ηλεκτροφόρηση γέλης για ανίχνευση μπορεί να εξαλειφθεί με την τεχνική PCR σε πραγματικό χρόνο. Η χρήση φθοριζόντων βαφών για την επισήμανση προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια των αντιδράσεων PCR θα οδηγήσει τελικά σε απευθείας ποσοτικοποίηση. Όταν συσσωρεύονται τα προϊόντα PCR, συσσωρεύονται και τα φθορίζοντα σήματα και θα μετρηθούν από τη μηχανή πραγματικού χρόνου. Το SYBR Green και το Taqman είναι δύο μέθοδοι ανίχνευσης ή παρακολούθησης της διαδικασίας ενίσχυσης της PCR σε πραγματικό χρόνο. Και οι δύο μέθοδοι παρακολουθούν την πρόοδο της διαδικασίας ενίσχυσης και αναφέρουν την ποσότητα του προϊόντος σε πραγματικό χρόνο.
Εικόνα 03: PCR σε πραγματικό χρόνο
Η PCR σε πραγματικό χρόνο έχει μεγάλη ποικιλία εφαρμογών, όπως ποσοτικοποίηση γονιδιακής έκφρασης, ανάλυση microRNA και μη κωδικοποιητικού RNA, γονότυπο SNP, ανίχνευση παραλλαγών αριθμού αντιγράφων, ανίχνευση σπάνιων μεταλλάξεων, ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών και ανίχνευση μολυσματικών παραγόντων.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ των συμβατικών ένθετων και των αναλύσεων PCR σε πραγματικό χρόνο;
- Οι δοκιμές PCR σε ένθετο και σε πραγματικό χρόνο είναι τροποποιήσεις της συμβατικής ανάλυσης PCR.
- Και οι τρεις τεχνικές ενισχύουν δείγματα DNA.
- Τα προϊόντα τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε αλληλουχία ή ανάλυση.
- Αυτές οι δοκιμές απαιτούν εκκινητές.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ των συμβατικών ένθετων και των αναλύσεων PCR σε πραγματικό χρόνο;
Η συμβατική PCR είναι μια τεχνική που αναπτύχθηκε για την ενίσχυση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA. Εν τω μεταξύ, η Nested PCR είναι μια τροποποίηση της συμβατικής PCR που αποτελείται από δύο διαδοχικές αντιδράσεις ενίσχυσης και η PCR πραγματικού χρόνου είναι μια παραλλαγή της συμβατικής PCR που μπορεί να ποσοτικοποιήσει το ενισχυμένο προϊόν. Έτσι, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ των συμβατικών ένθετων και των δοκιμασιών PCR σε πραγματικό χρόνο. Σε αντίθεση με τη συμβατική και την PCR πραγματικού χρόνου, η ένθετη PCR χρησιμοποιεί δύο σετ εκκινητών. Επιπλέον, υπάρχουν δύο διαδοχικές αντιδράσεις ενίσχυσης στην ένθετη PCR προκειμένου να μειωθεί η μη ειδική ενίσχυση. Επιπλέον, οι συμβατικές και οι δοκιμές PCR πραγματικού χρόνου δεν περιέχουν δύο διαδοχικές αντιδράσεις ενίσχυσης.
Το ακόλουθο infographic παραθέτει τις διαφορές μεταξύ των συμβατικών ένθετων και πραγματικών αναλύσεων PCR σε μορφή πίνακα για σύγκριση δίπλα-δίπλα.
Σύνοψη – Συμβατικές vs Nested vs Αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο
Η συμβατική PCR είναι η πρώτη τεχνική που αναπτύχθηκε για την ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA. Η Nested PCR και η PCR πραγματικού χρόνου είναι δύο παραλλαγές της συμβατικής PCR. Υπάρχουν δύο διαδοχικές αντιδράσεις ενίσχυσης και η χρήση δύο σετ εκκινητών σε ένθετη PCR. Η PCR πραγματικού χρόνου αναπτύσσεται για να ποσοτικοποιήσει το ενισχυμένο προϊόν PCR. Έτσι, αυτό συνοψίζει τη διαφορά μεταξύ των συμβατικών ένθετων και των δοκιμασιών PCR πραγματικού χρόνου.
