Η βασική διαφορά μεταξύ της μετάφρασης εγκοπής και της πλήρωσης του άκρου είναι ότι η μετάφραση εγκοπής είναι μια διαδικασία που δημιουργεί επισημασμένους ανιχνευτές DNA για διάφορες αντιδράσεις υβριδισμού, ενώ η πλήρωση άκρου είναι μια τεχνική που δημιουργεί αμβλεία θραύσματα προσθέτοντας νουκλεοτίδια σε μονόκλωνες προεξοχές.
Η μετάφραση εγκοπών και η πλήρωση του άκρου είναι δύο τεχνικές που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία. Η μετάφραση εγκοπής χρησιμοποιείται για την επισήμανση ανιχνευτών για υβριδισμό προκειμένου να ανιχνευθούν συγκεκριμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων. Η πλήρωση του άκρου χρησιμοποιείται για την κατασκευή αμβλυνών θραυσμάτων που είχαν κολλώδη άκρα με μονόκλωνους προεξοχές. Και οι δύο τεχνικές έχουν μεγάλη σημασία και εκτελούνται συνήθως σε εργαστήρια μοριακής έρευνας.
Τι είναι η μετάφραση Nick;
Η μετάφραση εγκοπής είναι μια σημαντική τεχνική που χρησιμοποιείται για την παρασκευή επισημασμένων ανιχνευτών για διάφορες μοριακές βιολογικές τεχνικές όπως στύπωμα, in situ υβριδισμός, υβριδισμός φθορισμού in situ κ.λπ. Είναι μια in vitro μέθοδος σήμανσης DNA. Οι ανιχνευτές DNA χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA ή RNA. Με τη βοήθεια ενός επισημασμένου ανιχνευτή, συγκεκριμένα θραύσματα μπορούν να επισημανθούν ή να οραματιστούν από ένα πολύπλοκο μείγμα νουκλεϊκού οξέος. Επομένως οι επισημασμένοι ανιχνευτές παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές. Η μετάφραση εγκοπής είναι μια τέτοια μέθοδος που παράγει επισημασμένους ανιχνευτές με τη βοήθεια ενζύμων DNase 1 και DNA πολυμεράσης 1.
Εικόνα 01: Nick Translation
Η διαδικασία μετάφρασης Nick ξεκινά με τη δραστηριότητα του ενζύμου DNase 1. Η DNase 1 εισάγει εγκοπές στη φωσφορική ραχοκοκαλιά του δίκλωνου DNA με διάσπαση φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ νουκλεοτιδίων. Μόλις δημιουργηθεί η εγκοπή, θα παραχθεί ελεύθερη ομάδα 3' ΟΗ του νουκλεοτιδίου και το ένζυμο DNA πολυμεράση 1 θα δράσει σε αυτό. Η δραστηριότητα 5' έως 3' εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης 1 αφαιρεί τα νουκλεοτίδια από την εγκοπή προς την κατεύθυνση 3' του κλώνου DNA.
Ταυτόχρονα, η δραστηριότητα πολυμεράσης του ενζύμου DNA πολυμεράση 1 λειτουργεί και προσθέτει νουκλεοτίδια για να αντικαταστήσει τα νουκλεοτίδια που αφαιρέθηκαν. Εάν τα νουκλεοτίδια είναι επισημασμένα, η αντικατάσταση θα γίνει από τα επισημασμένα νουκλεοτίδια και θα σημαδέψει το DNA για αναγνώριση. Τέλος, αυτό το πρόσφατα συντιθέμενο επισημασμένο DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτές σε διάφορες αντιδράσεις υβριδισμού.
Τι είναι το Τελικό Γέμισμα;
Το γέμισμα του άκρου είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στη μοριακή βιολογία για την κατασκευή αμβλυμένων θραυσμάτων. Η περιοριστική πέψη παράγει θραύσματα με προεξοχές. Αυτά τα θραύσματα μπορεί να μην είναι συμβατά για σύνδεση σε φορείς πλασμιδίου. Τα διανύσματα συχνά αμβλύνονται για να επιτρέπεται η ένωση μη συμβατών άκρων. Επομένως, θραύσματα με προεξοχές μπορούν να αμβλυνθούν προσθέτοντας τα νουκλεοτίδια στον συμπληρωματικό κλώνο χρησιμοποιώντας την προεξοχή ως εκμαγείο για πολυμερισμό. Αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως πλήρωση τέλους.
Οι πολυμεράσες DNA όπως το θραύσμα Klenow της DNA πολυμεράσης Ι και η Τ4 DNA πολυμεράση καταλύουν το τελικό γέμισμα. Προσθέτουν νουκλεοτίδια για να συμπληρώσουν (5′ → 3′) και μασούν πίσω (3′ → 5′). Μόλις γεμίσουν τα κολλώδη άκρα, γίνονται αμβλεία και είναι έτοιμα να απολινωθούν σε ένα διάνυσμα.
Επιπλέον, το τελικό γέμισμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση μορίων DNA. Ωστόσο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για την επισήμανση μορίων DNA με κολλώδη άκρα. Σε σύγκριση με τη μετάφραση με το ψευδώνυμο, η πλήρωση του άκρου είναι μια πιο ήπια μέθοδος που σπάνια προκαλεί θραύση του DNA.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ Nick Translation και End Filling;
- Τόσο η μετάφραση του χαραγού όσο και η πλήρωση του άκρου είναι μοριακές βιολογικές τεχνικές.
- Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επισήμανση ανιχνευτών.
- Και τα δύο είναι in vitro
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Nick Translation και End Filling;
Η μετάφραση με το Nick είναι μια τεχνική που δημιουργεί επισημασμένους ανιχνευτές για υβριδισμό. Αντίθετα, η πλήρωση του άκρου είναι μια τεχνική που δημιουργεί αμβλεία θραύσματα για απολίνωση σε φορείς. Έτσι, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ της μετάφρασης ψευδώνυμου και της πλήρωσης τέλους. Επιπλέον, η μετάφραση Nick απαιτεί τη χρήση δραστηριότητας εξωνουκλεάσης 5' έως 3' ενώ η τελική πλήρωση δεν απαιτεί δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5' έως 3'.
Το παρακάτω infographic παρουσιάζει με περισσότερες λεπτομέρειες τις διαφορές μεταξύ μετάφρασης ψευδώνυμου και συμπλήρωσης τέλους.
Summary – Nick Translation vs End Filling
Η μετάφραση εγκοπής είναι μια μέθοδος που ενσωματώνει ραδιοσημασμένα νουκλεοτίδια στο DNA. Συνθέτει επισημασμένους ανιχνευτές με βάση τις δραστηριότητες των ενζύμων DNase 1 και E. coli DNA πολυμεράσης 1. Η πλήρωση του άκρου, από την άλλη πλευρά, είναι μια τεχνική που παράγει αμβλέα θραύσματα. Όταν τα θραύσματα έχουν κολλώδη άκρα (μονόκλωνες προεξοχές), είναι απαραίτητο να γίνουν αμβλυμένα άκρα για να απολινωθούν σε φορείς. Η πλήρωση του άκρου προσθέτει συμβατά νουκλεοτίδια και δημιουργεί αμβλέα ακραία θραύσματα προκειμένου να τα καταστήσει συμβατά για απολίνωση. Έτσι, αυτό συνοψίζει τη διαφορά μεταξύ μετάφρασης ψευδώνυμου και πλήρωσης τέλους.
