Βασική διαφορά – Nick Translation vs Primer Extension
Η μετάφραση εγκοπής και η επέκταση εκκινητή είναι δύο σημαντικές τεχνικές που εκτελούνται στη Μοριακή βιολογία. Η βασική διαφορά μεταξύ μετάφρασης εγκοπής και επέκτασης εκκινητή είναι ότι η διαδικασία μετάφρασης εγκοπής παράγει επισημασμένους ανιχνευτές για άλλες τεχνικές υβριδισμού, ενώ η μέθοδος επέκτασης εκκινητών προσδιορίζει μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA από ένα μείγμα και αποκαλύπτει πληροφορίες σχετικά με την έκφραση του mRNA. Και οι δύο τεχνικές έχουν μεγάλη σημασία και εκτελούνται τακτικά σε εργαστήρια μοριακής έρευνας.
Τι είναι η μετάφραση του Nick;
Η μετάφραση εγκοπής είναι μια σημαντική τεχνική που χρησιμοποιείται για την παρασκευή επισημασμένων ανιχνευτών για διάφορες μοριακές βιολογικές τεχνικές όπως στύπωμα, υβριδισμός in situ, υβριδισμός in situ φθορισμού κ.λπ. Είναι μια in vitro μέθοδος σήμανσης του DNA. Οι ανιχνευτές DNA χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA ή RNA. Με τη βοήθεια ενός επισημασμένου ανιχνευτή, συγκεκριμένα θραύσματα μπορούν να επισημανθούν ή να οραματιστούν από ένα πολύπλοκο μείγμα νουκλεϊκού οξέος. Επομένως, οι επισημασμένοι ανιχνευτές παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές που θα χρησιμοποιηθούν για διαφορετικές τεχνικές. Η μετάφραση εγκοπής είναι μια τέτοια μέθοδος που παράγει επισημασμένους ανιχνευτές με τη βοήθεια ενζύμων DNase 1 και DNA πολυμεράσης 1.
Η διαδικασία μετάφρασης του ψευδώνυμου ξεκινά με τη δραστηριότητα του ενζύμου DNase 1. Η DNase 1 εισάγει εγκοπές στη φωσφορική ραχοκοκαλιά του δίκλωνου DNA με διάσπαση φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ νουκλεοτιδίων. Μόλις δημιουργηθεί η εγκοπή, η ελεύθερη ομάδα 3' ΟΗ του νουκλεοτιδίου θα αποδοθεί και το ένζυμο DNA πολυμεράση 1 θα δράσει σε αυτό. Η δραστικότητα εξωνουκλεάσης 5' έως 3' της DNA πολυμεράσης 1 αφαιρεί τα νουκλεοτίδια από την εγκοπή προς την κατεύθυνση 3' του κλώνου DNA. Ταυτόχρονα, η δραστικότητα πολυμεράσης του ενζύμου DNA πολυμεράση 1 λειτουργεί και προσθέτει νουκλεοτίδια για να αντικαταστήσει τα νουκλεοτίδια που αφαιρέθηκαν. Εάν τα νουκλεοτίδια ήταν επισημασμένα, η αντικατάσταση θα γίνει από τα επισημασμένα νουκλεοτίδια και θα σημαδέψει το DNA για αναγνώριση. Αυτό το πρόσφατα συντιθέμενο επισημασμένο DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτές σε διάφορες αντιδράσεις υβριδισμού στη Μοριακή Βιολογία.
Εικόνα 01: Διαδικασία μετάφρασης Nick
Τι είναι το Primer Extension;
Η επέκταση εκκινητή είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την εύρεση συγκεκριμένης αλληλουχίας RNA από ένα μείγμα RNA και τον εντοπισμό του 5' άκρου του μεταγράφου mRNA. Χρησιμοποιείται επίσης για τη μελέτη της δομής του RNA και της έκφρασης. Η μέθοδος επέκτασης εκκινητών πραγματοποιείται με επισημασμένους εκκινητές ή με επισημασμένα νουκλεοτίδια. Εάν χρησιμοποιούνται επισημασμένοι εκκινητές, αποκλείεται η ανάγκη επισήμανσης των νουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση του cDNA. Υπάρχουν πολλά βήματα σε αυτή την τεχνική. Ξεκινά με την εξαγωγή RNA από το δείγμα. Στη συνέχεια, ένας επισημασμένος ολιγονουκλεοτιδικός εκκινητής προστίθεται στο μείγμα μαζί με τα απαραίτητα συστατικά για τη σύνθεση cDNA μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας RNA. Το αστάρι ανόπτεται με τη συμπληρωματική αλληλουχία από το μείγμα. Χρησιμοποιώντας την αλληλουχία που έχει συγκολληθεί με εκκινητή ως μήτρα, το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει το συμπληρωματικό DNA (cDNA) της αλληλουχίας RNA. Η ανόπτηση εκκινητών και η αντίστροφη μεταγραφή συμβαίνουν μόνο όταν η συγκεκριμένη αλληλουχία RNA είναι παρούσα στο δείγμα. Τέλος, όταν εκτελείται ηλεκτροφόρηση μετουσιωτικής γέλης, μπορεί να προσδιοριστεί το μέγεθος της αλληλουχίας RNA. Είναι επίσης εύκολο να βρεθεί η βάση +1 της αλληλουχίας mRNA (θέση έναρξης μεταγραφής) με τη μέθοδο επέκτασης εκκινητή. Η ποσότητα του mRNA που υπάρχει στο δείγμα μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με αυτή τη μέθοδο εάν χρησιμοποιηθεί περίσσεια εκκινητή.
Εικόνα 02: Επέκταση Primer
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Nick Translation και Primer Extension;
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick translation είναι μια διαδικασία που δημιουργεί επισημασμένους ανιχνευτές DNA για διάφορες αντιδράσεις υβριδισμού. | Η επέκταση εκκινητή είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την εύρεση συγκεκριμένου RNA ή για τη μελέτη γονιδιακής έκφρασης. |
| Ένζυμα που χρησιμοποιούνται | |
| Χρησιμοποιούνται DNase 1 και ένζυμα DNA πολυμεράσης. | Χρησιμοποιείται ένζυμο ανάστροφης μεταγραφάσης. |
| Σημασία | |
| Η μετάφραση ψευδωνύμου διευκολύνει τη σήμανση συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. | Η επέκταση εκκινητή επιτρέπει την ανίχνευση συγκεκριμένου μεγέθους αλληλουχίας mRNA και της ποσότητας που υπάρχει στο δείγμα. |
Σύνοψη – Nick Translation vs Primer Extension
Μετάφραση Nick είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη σύνθεση επισημασμένων ανιχνευτών με βάση τις δραστηριότητες των ενζύμων DNase 1 και E coli DNA πολυμεράσης 1. Είναι μια μέθοδος in vitro που χρησιμοποιείται στα εργαστήρια πριν από διαφορετικές τεχνικές υβριδισμού. Κατά τη μετάφραση εγκοπής, η δραστηριότητα εξωνουκλεάσης 5'-3' της πολυμεράσης DNA 1 αφαιρεί τα νουκλεοτίδια μπροστά από την εγκοπή και η δραστηριότητα πολυμεράσης της πολυμεράσης DNA 1 αντικαθιστά τα αφαιρεθέντα νουκλεοτίδια με επισημασμένα νουκλεοτίδια πίσω από την εγκοπή. Η επέκταση εκκινητή είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου μεταγράφου RNA από ένα μείγμα και τον ποσοτικό προσδιορισμό του μεγέθους και της ποσότητας του ενδιαφέροντος RNA. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ μετάφρασης ψευδώνυμου και επέκτασης εκκινητή.
