Βασική διαφορά – PCR έναντι αλληλουχίας DNA
Η PCR και η αλληλουχία DNA είναι δύο σημαντικές τεχνικές στη Μοριακή Βιολογία. Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) είναι η διαδικασία που δημιουργεί μεγάλο αριθμό αντιγράφων ενός θραύσματος DNA. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας DNA είναι η τεχνική που οδηγεί στην ακριβή σειρά των νουκλεοτιδίων ενός δεδομένου θραύσματος DNA. Αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας PCR και του DNA. Η PCR είναι ένα από τα κύρια βήματα που εμπλέκονται στον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA.
Τι είναι η PCR;
Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) είναι μια τεχνική ενίσχυσης DNA που χρησιμοποιείται στη Μοριακή Βιολογία. Παράγει χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Αυτή η μέθοδος αναπτύχθηκε από τον Kary Mullis το 1983. Σε αυτή την τεχνική, το θραύσμα DNA που πρόκειται να ενισχυθεί χρησιμεύει ως εκμαγείο και το ένζυμο πολυμεράσης DNA προσθέτει συμπληρωματικά νουκλεοτίδια στον εκκινητή που είναι διαθέσιμος στο μίγμα PCR. Στο τέλος της αντίδρασης PCR, συντίθενται πολλά αντίγραφα του δείγματος DNA.
Υπάρχουν διάφορα συστατικά του μείγματος PCR, όπως DNA, πολυμεράση DNA (Taq πολυμεράση), εκκινητές (εμπρός και ανάστροφος εκκινητές), νουκλεοτίδια (δομικά στοιχεία του DNA) και ένα ρυθμιστικό διάλυμα. Η PCR γίνεται μέσα σε μια μηχανή PCR και το σωστό μείγμα PCR θα πρέπει να φορτωθεί στη μηχανή και θα πρέπει να εκτελεστεί το σωστό πρόγραμμα. Αυτή η τεχνική επιτρέπει την παραγωγή χιλιάδων έως εκατομμυρίων αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA από μια πολύ μικρή ποσότητα DNA.
Οι αντιδράσεις PCR συμβαίνουν με κυκλικό τρόπο για να παραχθεί η ορατή ποσότητα προϊόντων PCR σε ένα πήκτωμα. Υπάρχουν τρία κύρια στάδια που εμπλέκονται σε μια αντίδραση PCR, δηλαδή μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητή και επέκταση κλώνου όπως φαίνεται στο Σχήμα 01. Αυτά τα τρία βήματα συμβαίνουν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. Το DNA υπάρχει σε δίκλωνη μορφή με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών βάσεων. Πριν από την εμπλοκή, το δίκλωνο DNA θα πρέπει να διαχωριστεί το ένα από το άλλο. Γίνεται δίνοντας υψηλή θερμοκρασία. Σε υψηλή θερμοκρασία, το δίκλωνο DNA μετουσιώνεται σε μονόκλωνο. Στη συνέχεια, οι εκκινητές θα πρέπει να έρθουν πιο κοντά στα πλευρικά άκρα του συγκεκριμένου θραύσματος ή του γονιδίου του DNA. Το Primer είναι ένα σύντομο κομμάτι μονόκλωνου DNA που είναι συμπληρωματικό της αλληλουχίας στόχου. Οι μπροστινοί και οι αντίστροφοι εκκινητές ανόπτονται με τις συμπληρωματικές βάσεις στα πλευρικά άκρα του μετουσιωμένου δείγματος DNA στη θερμοκρασία ανόπτησης. Τα αστάρια πρέπει να είναι ανθεκτικά στη θερμότητα. Μόλις οι εκκινητές ανόπτονται με δείγμα DNA, το ένζυμο πολυμεράσης taq ξεκινά τη σύνθεση των νέων κλώνων προσθέτοντας νουκλεοτίδια που είναι συμπληρωματικά στο DNA στόχο. Η πολυμεράση Taq είναι ένα θερμοσταθερό ένζυμο που απομονώνεται από ένα θερμόφιλο βακτήριο που ονομάζεται Thermus aquaticus. Το ρυθμιστικό PCR διατηρεί τις βέλτιστες συνθήκες για τη δράση της πολυμεράσης taq. Αυτά τα τρία στάδια των αντιδράσεων PCR επαναλαμβάνονται για να παραχθεί η απαιτούμενη ποσότητα προϊόντος PCR. Μετά από κάθε αντίδραση PCR, ο αριθμός του αντιγράφου DNA διπλασιάζεται. Ως εκ τούτου, μια εκθετική ενίσχυση μπορεί να παρατηρηθεί στην PCR. Τα προϊόντα PCR μπορούν να παρατηρηθούν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης και μπορούν να καθαριστούν για περαιτέρω μελέτες.
Εικόνα 01: Κύρια βήματα μιας αντίδρασης PCR
Η PCR είναι ένα πολύτιμο εργαλείο στην ιατρική και βιολογική έρευνα. Η PCR έχει ιδιαίτερη αξία στην ιατροδικαστική επιστήμη αφού μπορεί να ενισχύσει το DNA για μελέτες από τα μικροσκοπικά δείγματα από τους εγκληματίες και να δημιουργήσει ιατροδικαστικά προφίλ DNA. Η PCR χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς τομείς της μοριακής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένου του γονότυπου, της κλωνοποίησης γονιδίων, της ανίχνευσης μεταλλάξεων, του προσδιορισμού αλληλουχίας DNA, των μικροσυστοιχιών DNA και του τεστ πατρότητας κ.λπ.
Εικόνα 02: Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης
Τι είναι η αλληλουχία DNA;
Η Αλληλουχία DNA είναι ο προσδιορισμός μιας ακριβούς σειράς των νουκλεοτιδίων – αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη και θυμίνη σε ένα δεδομένο θραύσμα DNA. Οι γενετικές πληροφορίες αποθηκεύονται στις αλληλουχίες DNA χρησιμοποιώντας τη σωστή σειρά των νουκλεοτιδίων. Ως εκ τούτου, η εύρεση της ακριβούς σειράς των νουκλεοτιδίων σε ένα θραύσμα DNA είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε για τη δομή και τη λειτουργία των γονιδίων.
Το πρωτόκολλο αλληλουχίας DNA περιλαμβάνει διαφορετικές διαδικασίες. Το πρώτο βήμα είναι η απομόνωση του ενδιαφερόμενου DNA ή του γονιδιωματικού DNA ενός οργανισμού. Χρησιμοποιώντας PCR (όπως περιγράφεται παραπάνω), η επιθυμητή περιοχή του DNA θα πρέπει να ενισχυθεί. Το ενισχυμένο προϊόν PCR θα πρέπει να διαχωριστεί με ηλεκτροφόρηση γέλης και να καθαριστεί. Τα ενισχυμένα θραύσματα εξυπηρετούνται ως πρότυπα για την αλληλούχιση. Η αλληλουχία μπορεί να γίνει είτε ακολουθώντας την αλληλουχία Sanger είτε τη μέθοδο αλληλουχίας υψηλής απόδοσης. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger απαιτεί τριχοειδή ηλεκτροφόρηση των προκυπτόντων θραυσμάτων DNA. Ο προσδιορισμός της σωστής σειράς νουκλεοτιδίων μπορεί να γίνει με χειροκίνητη ανάγνωση αυτοραδιογραφημάτων ή με χρήση αυτοματοποιημένων αναλυτών αλληλουχίας DNA.
Η αλληλουχία γονιδίων συνέβαλε στο έργο του ανθρώπινου γονιδιώματος και διευκόλυνε τη χαρτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος το 2003. Στην εγκληματολογία, η αλληλουχία DNA επέτρεψε την ταυτοποίηση ατόμων που εμφανίζουν μοναδικές αλληλουχίες DNA και ταυτοποιούν τους εγκληματίες. Στην ιατρική, η αλληλουχία DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των γονιδίων που ευθύνονται για γενετικές και άλλες ασθένειες, την εύρεση γονιδίων ελαττωμάτων και την αντικατάστασή τους με σωστά γονίδια. Στη γεωργία, οι πληροφορίες αλληλουχίας DNA ορισμένων μικροοργανισμών χρησιμοποιούνται για την παραγωγή διαγονιδιακών καλλιεργειών με οικονομικά επιθυμητά χαρακτηριστικά.
Εικόνα 03: Αλληλουχία DNA
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ PCR και DNA Sequencing;
PCR vs DNA Sequencing |
|
| Η διαδικασία PCR δημιουργεί χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα του ενδιαφερόμενου θραύσματος DNA. | Αλληλουχία DNA είναι η διαδικασία προσδιορισμού της ακριβούς σειράς των νουκλεοτιδίων σε ένα δεδομένο θραύσμα DNA. |
| Έκβαση | |
| PCR δημιουργεί χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA | Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη σωστή σειρά των βάσεων σε ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA. |
| Συμμετοχή ddNTP | |
| Η PCR δεν απαιτεί ddNTP. Χρησιμοποιεί dNTP. | Η αλληλουχία DNA απαιτεί ddNTPs για τον τερματισμό του σχηματισμού κλώνου. |
Σύνοψη – PCR vs DNA Sequencing
Η PCR και η αλληλουχία DNA είναι πολύ σημαντικά εργαλεία σε πολλούς τομείς της Μοριακής Βιολογίας. Η ενίσχυση των θραυσμάτων DNA γίνεται με την τεχνική PCR ενώ η σωστή σειρά των νουκλεοτιδίων ενός θραύσματος DNA προσδιορίζεται από την αλληλουχία DNA. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ PCR και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.
