Βασική διαφορά – Northern vs Southern vs Western Blotting
Η ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA, RNA και πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για διάφορους τύπους μελετών στη Μοριακή βιολογία. Η ηλεκτροφόρηση γέλης είναι μια τεχνική που διαχωρίζει το DNA, το RNA και τις πρωτεΐνες ανάλογα με το μέγεθός τους. Από τα προφίλ γέλης, συγκεκριμένη αλληλουχία DNA, αλληλουχία RNA ή πρωτεΐνη ανιχνεύονται με τις ειδικές τεχνικές που ονομάζονται στύπωμα και υβριδισμός με επισημασμένους ανιχνευτές. Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί τύποι μεθόδων στυπώματος, δηλαδή η νότια, η βόρεια και η δυτική. Η βασική διαφορά μεταξύ του Northern Southern και του Western blotting έγκειται στον τύπο του μορίου που ανιχνεύει από ένα δείγμα. Το Southern blotting είναι μια μέθοδος που ανιχνεύει μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA από ένα δείγμα DNA. Το στύπωμα Northern είναι μια τεχνική που ανιχνεύει μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA από ένα δείγμα RNA. Το Western blotting είναι μια μέθοδος που ανιχνεύει μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη από ένα δείγμα πρωτεΐνης.
Τι είναι το Southern Blotting;
Η τεχνική κηλίδωσης Southern αναπτύχθηκε από τον E. M. Southern το 1975 για την ταυτοποίηση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA από ένα δείγμα DNA. Αυτή είναι η πρώτη τεχνική blotting που εισήχθη στη μοριακή βιολογία. Έδωσε τη δυνατότητα ανίχνευσης συγκεκριμένων γονιδίων από το DNA, συγκεκριμένων θραυσμάτων από DNA κ.λπ. Υπάρχουν πολλά βήματα που εμπλέκονται στην τεχνική του Southern blotting. Έχουν ως εξής.
- DNA απομονώνεται από το δείγμα και χωνεύεται με περιοριστικές ενδονουκλεάσες.
- Το χωνεμένο δείγμα διαχωρίζεται με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.
- Τα θραύσματα DNA στο πήκτωμα μετουσιώνονται σε μονούς κλώνους με τη χρήση αλκαλικού διαλύματος.
- Μονόκλωνο DNA μεταφέρεται σε μεμβράνη φίλτρου νιτροκυτταρίνης μέσω τριχοειδούς μεταφοράς.
- Το μεταφερόμενο DNA στερεώνεται μόνιμα στη μεμβράνη.
- Το σταθεροποιημένο DNA στη μεμβράνη υβριδοποιείται με επισημασμένους ανιχνευτές.
- Το μη δεσμευμένο DNA ξεπλένεται από τη μεμβράνη με πλύση.
- φιλμ ακτίνων Χ εκτίθεται στη μεμβράνη και παρασκευάζεται αυτοραδιογράφημα.
Η κηλίδωση Southern εφαρμόζεται για διαφορετικές πτυχές της μοριακής βιολογίας. Είναι χρήσιμο σε χαρτογράφηση RFLP, εγκληματολογικές μελέτες, μεθυλίωση DNA στην έκφραση γονιδίων, ανίχνευση μεταλλαγμένων γονιδίων σε γενετικές διαταραχές, δακτυλικά αποτυπώματα DNA κ.λπ.
Εικόνα 01: Southern Blotting Τεχνική
Τι είναι το Northern Blotting;
Το στύπωμα Northern είναι μια μέθοδος που έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας RNA ή αλληλουχίας mRNA από ένα δείγμα για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης. Αυτή η τεχνική αναπτύχθηκε από τους Alwine, Kemp και Stark το 1979. Διαφέρει από τις τεχνικές στυπώματος Southern και Western λόγω πολλών βημάτων. Ωστόσο, αυτή η τεχνική εκτελείται επίσης μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης, στύπωσης και υβριδισμού με ειδικούς επισημασμένους ανιχνευτές και ανίχνευσης. Η τεχνική Northern blotting εκτελείται ως εξής.
- Το RNA εξάγεται από το δείγμα και διαχωρίζεται με ηλεκτροφόρηση γέλης.
- Το RNA μεταφέρεται από το πήκτωμα σε μια μεμβράνη αποτύπωσης και σταθεροποιείται.
- Η μεμβράνη υποβάλλεται σε επεξεργασία με έναν επισημασμένο ανιχνευτή που παρασκευάζεται από cDNA ή RNA (ο ανιχνευτής είναι συμπληρωματικός σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία στο δείγμα).
- Ο ανιχνευτής επωάζεται με τη μεμβράνη για να συνδεθεί με μια συγκεκριμένη αλληλουχία.
- Οι μη δεσμευμένοι ανιχνευτές ξεπλένονται.
- Υβριδισμένα θραύσματα ανιχνεύονται με αυτοραδιογράφο.
Το Northern blotting είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του υβριδοποιημένου mRNA, τη μελέτη της αποικοδόμησης RNA, την αξιολόγηση του χρόνου ημιζωής του RNA, την ανίχνευση ματίσματος RNA, τη μελέτη γονιδιακής έκφρασης κ.λπ.
Εικόνα 02: Northern Blotting
Τι είναι το Western Blotting;
Το Western blotting είναι μια μέθοδος ανίχνευσης μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης από ένα μείγμα πρωτεϊνών με τη χρήση επισημασμένου αντισώματος. Επομένως, το western blot είναι επίσης γνωστό ως ανοσοκηλίδα. Αυτή η τεχνική εισήχθη από τους Towbin et al το 1979 και τώρα εκτελείται τακτικά στα εργαστήρια για ανάλυση πρωτεϊνών. Τα βήματα είναι τα εξής.
- Οι πρωτεΐνες εξάγονται από το δείγμα
- Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση τα μεγέθη τους χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου
- Διαχωρισμένα μόρια μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF ή μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με ηλεκτροδιάτρηση
- Η μεμβράνη είναι αποκλεισμένη για μη ειδική δέσμευση με τα αντισώματα
- Οι μεταφερόμενες πρωτεΐνες συνδέονται με πρωτεύον αντίσωμα (ενζυμικά επισημασμένα αντισώματα).
- Η μεμβράνη πλένεται για να αφαιρεθούν τα μη ειδικά συνδεδεμένα πρωτογενή αντισώματα
- Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύονται με την προσθήκη ενός υποστρώματος και την ανίχνευση του έγχρωμου ιζήματος που σχηματίζεται
Το Western blotting είναι χρήσιμο για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά του HIV σε δείγμα ανθρώπινου ορού. Το Western blot μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως επιβεβαιωτική εξέταση για λοίμωξη από ηπατίτιδα Β και οριστική δοκιμή για τη νόσο των τρελών αγελάδων.
Εικόνα 03: Western Blotting
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Northern Southern και Western Blotting;
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Εντοπίστηκε τύπος μορίου | |
| Northern Blotting | Northern blotting ανιχνεύει μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA από ένα δείγμα RNA. |
| Southern Blotting | Η κηλίδωση Southern ανιχνεύει μια συγκεκριμένη αλληλουχία DNA από ένα δείγμα DNA. |
| Western Blotting | Το Western blotting ανιχνεύει μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη από ένα δείγμα πρωτεΐνης. |
| Τύπος Gel | |
| Northern Blotting | Αυτό χρησιμοποιεί γέλη αγαρόζης/φορμαλδεΰδης. |
| Southern Blotting | Αυτό χρησιμοποιεί ένα τζελ αγαρόζης. |
| Western Blotting | Αυτό χρησιμοποιεί γέλη πολυακρυλαμιδίου. |
| Μέθοδος αποτύπωσης | |
| Northern Blotting | Πρόκειται για τριχοειδική μεταφορά. |
| Southern Blotting | Πρόκειται για τριχοειδική μεταφορά. |
| Western Blotting | Αυτή είναι μια ηλεκτρική μεταφορά. |
| Χρησιμοποιήθηκαν ανιχνευτές | |
| Northern Blotting | ανιχνευτές cDNA ή RNA επισημασμένοι ραδιενεργά ή μη ραδιενεργά. |
| Southern Blotting | Οι ανιχνευτές DNA επισημαίνονται ραδιενεργά ή μη ραδιενεργά. |
| Western Blotting | Τα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές. |
| Σύστημα ανίχνευσης | |
| Northern Blotting | Αυτό γίνεται με χρήση αυτοραδιογράφου ή ανίχνευσης φωτός ή αλλαγής χρώματος. |
| Southern Blotting | Αυτό γίνεται με χρήση αυτοραδιογράφου, ανίχνευσης φωτός ή αλλαγής χρώματος. |
| Western Blotting | Αυτό γίνεται χρησιμοποιώντας την ανίχνευση του φωτός ή της αλλαγής χρώματος. |
Σύνοψη – Northern vs Southern vs Western Blotting
Το Η αποτύπωση είναι μια ειδική τεχνική που αναπτύχθηκε για την ταυτοποίηση συγκεκριμένου DNA, RNA ή πρωτεΐνης από τα δείγματα. Υπάρχουν τρεις ξεχωριστές διαδικασίες αποτύπωσης, δηλαδή το βόρειο, το νότιο και το δυτικό, για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου τύπου μορίου. Η τεχνική Northern blotting έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύει μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA από ένα μείγμα RNA. Η τεχνική Southern blotting επιτρέπει την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA από ένα δείγμα DNA και η τεχνική western blotting αναπτύσσεται για την αναγνώριση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης από ένα μείγμα πρωτεϊνών.
