Βασική διαφορά – Blunt vs Sticky End Ligation
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι συγκεκριμένα ένζυμα που κόβουν το δίκλωνο DNA (dsDNA). Είναι επίσης γνωστά ως μοριακό ψαλίδι στη Μοριακή βιολογία. Τα περιοριστικά ένζυμα είναι σε θέση να αναγνωρίσουν συγκεκριμένες μικρές αλληλουχίες του dsDNA γνωστές ως θέσεις αναγνώρισης και να διασπούν δεσμούς φωσφοδιεστέρα και υδρογόνου για να ανοίξουν διπλούς κλώνους. Ως αποτέλεσμα της διάσπασης από αυτά τα ένζυμα, παράγονται θραύσματα DNA με διαφορετικούς τύπους άκρων, όπως κολλώδη άκρα και αμβλεία άκρα. Η DNA λιγάση είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιείται στη Μοριακή βιολογία για να ενώσει δύο γειτονικούς κλώνους DNA σχηματίζοντας νέους δεσμούς. Το στάδιο είναι γνωστό ως απολίνωση και σύμφωνα με τον τύπο του απολινωμένου άκρου DNA, μπορεί να αναφέρεται ως απολίνωση αμβλύ άκρου και απολίνωση κολλώδους άκρου. Η βασική διαφορά μεταξύ της απολίνωσης αμβλύ και κολλώδους άκρου είναι ότι η απολίνωση με αμβλύ άκρο συμβαίνει μεταξύ θραυσμάτων DNA που περιέχουν δύο αμβλεία άκρα ενώ η απολίνωση κολλώδους άκρου συμβαίνει μεταξύ προεξοχών 5' και 3'. Σε σύγκριση με την απολίνωση με αμβλύ άκρο, η απολίνωση με κολλώδες άκρο είναι πιο αποτελεσματική και σταθερή.
Τι είναι η απολίνωση με αμβλύ άκρο;
Ορισμένες περιοριστικές ενδονουκλεάσες μπορούν να κόψουν το DNA στις αντίθετες βάσεις και να παράγουν θραύσματα DNA αμβλύτερων άκρων. Αυτά τα ένζυμα είναι γνωστά ως κοπτικά με αμβλύ άκρο. διασπώνται κατευθείαν μέχρι το μέσο της περιοχής περιορισμού χωρίς να αφήνουν μονόκλωνες προεξέχουσες βάσεις. Τα αμβλέα άκρα είναι επίσης γνωστά ως μη προεξέχοντα άκρα, καθώς δεν έχουν προεξέχουσες βάσεις 3' και 5' στα άκρα. Και οι δύο κλώνοι καταλήγουν από ζεύγη βάσεων σε αμβλέα άκρα. Τα κοινά ένζυμα κοπής αμβλείας άκρης είναι τα EcoRV HaeIII, AluI και SmaI.
Η απολίνωση αμβλυμένου άκρου εμπλέκεται μεταξύ δύο αμβλέων άκρων. Δεν είναι απολίνωση βάσεων που προεξέχουν. Αυτή η απολίνωση είναι λιγότερο αποτελεσματική από την απολίνωση με κολλώδη άκρα. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, η απολίνωση με αμβλύ άκρο γίνεται πιο πλεονεκτική από την απολίνωση με κολλώδες άκρο, ειδικά όταν απολινώνονται προϊόντα PCR. Τα προϊόντα PCR παράγονται πάντα με αμβλύ άκρο. Η απολίνωση με αμβλύ άκρο δεν απαιτεί συμπληρωματικά άκρα στο DNA για την απολίνωση.
Εικόνα 01: Παραγωγή αμβλύ άκρου από ένζυμο Eco RV
Τι είναι η απολίνωση με κολλώδη άκρο;
Ορισμένες περιοριστικές ενδονουκλεάσες μπορούν να κόψουν το dsDNA, αφήνοντας ένα προεξέχον κομμάτι μονόκλωνου DNA στο τέλος. Αυτά τα άκρα είναι γνωστά ως κολλώδη ή προεξέχοντα άκρα. Η σύνδεση κολλώδους άκρου συμβαίνει μεταξύ δύο θραυσμάτων DNA που περιέχουν ταιριαστές προεξοχές επειδή τα κολλώδη άκρα έχουν μη ζευγαρωμένες βάσεις και απαιτούν συμπληρωματικές βάσεις για να σχηματίσουν δεσμούς. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθεί το ίδιο ένζυμο περιορισμού και για τις δύο πηγές DNA για την παραγωγή των ταιριασμένων θραυσμάτων απολίνωσης.
Η απολίνωση με κολλώδες άκρο είναι πιο αποτελεσματική και συχνά είναι ιδιαίτερα επιθυμητή στις διαδικασίες κλωνοποίησης. Υπάρχουν πολλά περιοριστικά ένζυμα που παράγουν κολλώδη άκρα. Είναι EcoRI, BamHI, HindIII κ.λπ.
Εικόνα 02: Παραγωγή κολλώδους άκρου από ένζυμο Eco RI
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Blunt και Sticky End Ligation;
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Η απολίνωση αμβλυμένου άκρου συμβαίνει μεταξύ δύο θραυσμάτων DNA αμβλέων άκρων. | Η απολίνωση κολλώδους άκρου συμβαίνει μεταξύ δύο ταιριασμένων θραυσμάτων DNA με κολλώδη άκρα. |
| Ένζυμα | |
| Οι κοπτήρες με αμβλύ άκρο παράγουν αμβλεία άκρα. | Οι κόφτες με κολλώδη άκρα παράγουν κολλώδη ή συνεκτικά άκρα. |
| Απαίτηση αντιστοίχισης άκρων | |
| Δεν απαιτεί ταιριαστά θραύσματα ή συμπληρωματικές βάσεις. | Απαιτούνται συμπληρωματικές βάσεις στα άκρα για να σχηματιστούν ζεύγη βάσεων. |
| Αποτελεσματικότητα | |
| Είναι λιγότερο αποτελεσματικό από την απολίνωση με κολλώδες άκρο | Είναι πιο αποτελεσματική από την απολίνωση με αμβλύ άκρο. |
Σύνοψη – Blunt vs Sticky End Ligation
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι σε θέση να διασπάσουν το dsDNA και να παράγουν θραύσματα DNA με διαφορετικά άκρα. Αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες και περιορίζουν το DNA δημιουργώντας κολλώδη και αμβλεία άκρα. Τα κολλώδη άκρα έχουν μη ζευγαρωμένες βάσεις στο άκρο των θραυσμάτων. Τα αμβλεία άκρα δημιουργούνται λόγω ευθύγραμμης διάσπασης και έχουν ζεύγη βάσεων στα άκρα. Η απολίνωση του κολλώδους άκρου απαιτεί δύο συμπληρωματικά μονόκλωνα κομμάτια DNA. Η απολίνωση του αμβλύ άκρου συμβαίνει μεταξύ οποιωνδήποτε δύο θραυσμάτων αμβλέων άκρων. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ αμβλείας και κολλώδους απολίνωσης.
