Βασική διαφορά – Εκκινητές PCR έναντι Εκκινητών Αλληλουχίας
Με τις πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα της μοριακής βιολογίας, αναπτύχθηκαν διαφορετικές γενετικές τεχνικές που έκαναν τις διαδικασίες έρευνας διαφορετικών οδών του θέματος εύκολες και ακριβείς. Η PCR και άλλες διαδικασίες προσδιορισμού αλληλουχίας είναι δύο σημαντικές τέτοιες τεχνικές. Χρησιμοποιούν διαφορετικά υποσυστατικά. Οι εκκινητές θεωρούνται ως το κύριο υποσυστατικό κοινό τόσο για τις τεχνικές PCR όσο και για την Αλληλουχία. Οι εκκινητές PCR χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA ενώ οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο προσδιορισμού αλληλουχίας ενός θραύσματος DNA με σκοπό να αποκαλυφθεί η ειδική του σειρά της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ των εκκινητών PCR και των εκκινητών προσδιορισμού αλληλουχίας.
Τι είναι οι εκκινητές PCR;
Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) είναι μια γενετική τεχνική που χρησιμοποιείται στον τομέα της μοριακής βιολογίας προκειμένου να ενισχυθεί ένα ή λίγα αντίγραφα ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA και να ληφθούν πολλά εκατομμύρια πανομοιότυπα αντίγραφα. Σε μια αντίδραση PCR, χρησιμοποιούνται διαφορετικά συστατικά συμπεριλαμβανομένων των εκκινητών. Οι εκκινητές είναι σύντομοι κλώνοι DNA με μήκος νουκλεοτιδίου 18-25 που τους καθιστά συμβατούς με την αρχική και την τελική περιοχή των θραυσμάτων DNA που πρόκειται να ενισχυθούν. Τα αστάρια μπορούν να είναι ένα μπροστινό αστάρι και ένα ανάστροφο αστάρι. Αυτοί οι εκκινητές συνδέονται με το θραύσμα DNA στα συγκεκριμένα σημεία όπου κάνει την πολυμεράση DNA να συνδέεται με τον συγκεκριμένο εκκινητή στη θέση και ξεκινά τη σύνθεση του νέου κλώνου DNA.
Η επιλογή των εκκινητών είναι μια σημαντική πτυχή της διαδικασίας PCR. Η επιλογή του μήκους του ασταριού είναι σημαντική. Το ιδανικό μήκος θα ήταν 18-25 νουκλεοτίδια. Εάν το μήκος είναι πολύ μικρό ή πολύ μεγάλο, οι εκκινητές δεν θα συνδεθούν με την αλληλουχία DNA που πρόκειται να ενισχυθεί με ακρίβεια. Οι εκκινητές που είναι πολύ μικροί σε μήκος οδηγούν σε μη ειδική ανόπτηση εκκινητών σε διαφορετικές θέσεις της αλληλουχίας DNA.
Εικόνα 01: Εκκινητές PCR
Η περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη (GC) σε ένα καλό αστάρι θα πρέπει να κυμαίνεται από 40-60. Η θερμοκρασία ανόπτησης του εκκινητή και η θερμοκρασία τήξης είναι ζωτικοί παράγοντες κατά τη διάρκεια της PCR. Η θερμοκρασία τήξης πρέπει να υπολογίζεται με ακρίβεια και η θερμοκρασία ανόπτησης του ασταριού πρέπει να είναι 5 0C μικρότερη από τη θερμοκρασία τήξης. Η θερμοκρασία τήξης πρέπει να είναι 60 °C και 75 °C. Οι πολύ υψηλές ή πολύ χαμηλές θερμοκρασίες θα έχουν ως αποτέλεσμα λιγότερο ενεργή δραστηριότητα πολυμεράσης DNA.
Τι είναι οι εκκινητές αλληλουχίας;
Οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο προσδιορισμού αλληλουχίας ενός θραύσματος DNA με σκοπό την αποκάλυψη της ειδικής ταυτότητάς του. Για την επίτευξη καλών αποτελεσμάτων αλληλουχίας είναι σημαντικά οι εκκινητές και τα πρότυπα υψηλής ποιότητας. Έτσι, όταν επιλέγονται εκκινητές, θα πρέπει να είναι μοναδικοί σε μια συγκεκριμένη περιοχή όπου επιθυμούμε να προσδιορίσουμε την αλληλουχία. Θα πρέπει επίσης να είναι με σωστό προσανατολισμό όπου οι αλληλουχίες δημιουργούνται συνήθως από τα άκρα 3' έως 5' των εκκινητών. Η ακολουθία θα πρέπει να στερείται ανεπιθύμητου αυτο-υβριδισμού όπως ο σχηματισμός θηλιών φουρκέτας. Δεν πρέπει να περιέχει διαδοχικούς σχηματισμούς βάσεων γουανίνης.
Η θερμοκρασία τήξης (Tm) του ασταριού πρέπει να είναι κατάλληλη για τις συνθήκες της αλληλουχίας. Επομένως, θα πρέπει να βρίσκεται μεταξύ 52oC και 74oC. Η παρασκευή ολιγονουκλεοτιδίων που θα χρησιμοποιηθούν ως εκκινητής θα πρέπει να καθαριστεί για να ληφθεί το επιθυμητό πλήρες μήκος της αλληλουχίας. Εάν τα ολιγονουκλεοτίδια περιέχουν ακαθαρσίες, η σηματοδότηση της αλληλουχίας εκκινητών θα υπερτίθεται από διαφορετικές θέσεις εκκίνησης και επίσης θα μειώσει τον αριθμό των βασικών κυττάρων.
Εικόνα 02: Εκκινητές αλληλουχίας
Η θερμοκρασία τήξης του εκκινητή (Tm) ενός ολιγονουκλεοτιδίου καθορίζει πόσο ισχυροί υβριδίζονται μεταξύ τους οι συμπληρωματικοί κλώνοι DNA. Το Tm μπορεί να θεωρηθεί ως ένας θερμοδυναμικός υπολογισμός όπου εξαρτάται τόσο από αλληλουχίες DNA όσο και από διάφορες συνθήκες όπως η συγκέντρωση άλατος. Το Tm είναι σημαντικό κατά τη διάρκεια της PCR όπου χρησιμοποιείται μια παραλλαγή που ονομάζεται κυκλική αλληλουχία για την παραγωγή μιας ομάδας θραυσμάτων με τερματικά διδεοξυνουκλεοτίδια. Εδώ, ο εκκινητής που προσδιορίζεται η αλληλουχία αρχικά θα ανόπτεται εναλλακτικά, στη συνέχεια θα επεκταθεί και τελικά θα μετουσιωθεί για ενίσχυση. Επομένως, η τιμή Tm θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 52oC και 74o C. Τα συντιθέμενα ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να ληφθούν από εργαστήρια σύνθεσης DNA/RNA σύμφωνα με επιλογή. Η μικρή κλίμακα σύνθεσης που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA είναι συνήθως 50 nmol. Επίσης, το πιο σημαντικό είναι ότι οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την αλληλούχιση πρέπει να καθαρίζονται ώστε να είναι απαλλαγμένοι από ακαθαρσίες που θα αποτρέψουν τη μείωση της ποιότητας.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ των εκκινητών PCR και των εκκινητών αλληλουχίας;
- Τόσο οι εκκινητές PCR όσο και οι εκκινητές αλληλουχίας είναι εκκινητές που χρησιμοποιούνται στη διαδικασία ενίσχυσης μιας στοχευμένης αλληλουχίας DNA.
- Τόσο οι εκκινητές PCR όσο και οι εκκινητές αλληλουχίας αποτελούνται από νουκλεοτίδια.
- Τόσο οι εκκινητές PCR όσο και οι εκκινητές αλληλουχίας είναι βραχέα ολιγομερή.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ των εκκινητών PCR και των εκκινητών αλληλουχίας;
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| Οι εκκινητές PCR είναι σύντομοι κλώνοι DNA με μήκος νουκλεοτιδικής αλληλουχίας 18-25, καθιστώντας τους συμβατούς με την αρχική και την τελική περιοχή των θραυσμάτων DNA που πρόκειται να ενισχυθούν. | Οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας είναι βραχέα ολιγομερή που χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο προσδιορισμού αλληλουχίας ενός θραύσματος DNA με σκοπό να αποκαλυφθεί η συγκεκριμένη ταυτότητά του. |
| Συνάρτηση | |
| PCR εκκινητές χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. | Οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο του προσδιορισμού αλληλουχίας ενός θραύσματος DNA με σκοπό να αποκαλυφθεί η συγκεκριμένη ταυτότητά του. |
| Αριθμός εκκινητών που χρειάζονται | |
| Δύο εκκινητές; ένας εκκινητής προς τα εμπρός και ένας ανάστροφος εκκινητής χρησιμοποιούνται ως εκκινητές PCR. | Χρειάζεστε μόνο έναν εκκινητή ως εκκινητή αλληλουχίας. |
Σύνοψη – PCR Primers vs Sequencing Primers
Οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο προσδιορισμού αλληλουχίας ενός θραύσματος DNA με σκοπό την αποκάλυψη της ειδικής ταυτότητάς του. Ένας εκκινητής αλληλουχίας θα είναι αρκετός για την εκτέλεση της διαδικασίας. Για να επιτευχθούν καλά αποτελέσματα αλληλουχίας, είναι σημαντικά εκκινητές και πρότυπα υψηλής ποιότητας. Έτσι, όταν επιλέγονται εκκινητές, θα πρέπει να είναι μοναδικοί σε μια συγκεκριμένη περιοχή όπου επιθυμούμε να προσδιορίσουμε την αλληλουχία. Οι εκκινητές PCR είναι σύντομοι κλώνοι DNA με μήκος νουκλεοτιδίου 18-25 που είναι συμβατό με την αρχική και την τελική περιοχή των θραυσμάτων DNA που πρόκειται να ενισχυθούν. Οι εκκινητές PCR μπορούν να είναι ένας εμπρόσθιος εκκινητής και ένας αντίστροφος εκκινητής. Η περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη (GC) σε ένα καλό αστάρι θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40-60. Η θερμοκρασία ανόπτησης του εκκινητή και η θερμοκρασία τήξης είναι ζωτικής σημασίας στοιχεία κατά τη διάρκεια της PCR. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ των εκκινητών PCR και των εκκινητών Sequencing.
