Key Difference – Forward vs Reverse Primer
Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος ενίσχυσης DNA που χρησιμοποιείται σε εφαρμογές Μοριακής Βιολογίας. Είναι μια συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική που δημιουργεί εκατομμύρια έως δισεκατομμύρια αντίγραφα μιας ιδιαίτερα ενδιαφέρουσας αλληλουχίας DNA. Είναι μια μέθοδος in vitro που πραγματοποιείται σε εργαστήρια. Η τεχνική PCR εξαρτάται πλήρως από την εμπορικά παραγόμενη πολυμεράση DNA που ονομάζεται πολυμεράση Taq. Και επίσης απαιτεί πολλά άλλα εξαρτήματα και σωστή συντήρηση θερμοκρασίας. Ένα σημαντικό συστατικό είναι τα αστάρια. Οι εκκινητές είναι οι σύντομες αλληλουχίες DNA που έχουν σχεδιαστεί ειδικά για την αλληλουχία DNA στόχο. Είναι συνήθως περίπου 20 νουκλεοτίδια σε μήκος. Η πολυμεράση Taq καταλύει την προσθήκη νουκλεοτιδίων σε προϋπάρχουσα νουκλεοτιδική αλληλουχία. Ως εκ τούτου, οι εκκινητές χρησιμεύουν ως σημεία έναρξης της σύνθεσης νέων κλώνων. Η πολυμεράση Taq λειτουργεί μόνο σε κατεύθυνση 5' έως 3', επομένως η σύνθεση DNA λαμβάνει χώρα στην ίδια κατεύθυνση 5' προς 3'. Δεδομένου ότι το DNA είναι δίκλωνο, χρειάζονται δύο τύποι εκκινητών στην PCR. Είναι γνωστά ως μπροστινό αστάρι και αντίστροφο αστάρι. Οι μπροστινοί και οι αντίστροφοι εκκινητές ορίζονται με βάση την κατεύθυνση της επιμήκυνσης του εκκινητή στο DNA όταν συμβαίνει σύνθεση DNA. Ο μπροστινός εκκινητής ανόπτεται με τον αντιπληροφοριακό κλώνο DNA και ξεκινά τη σύνθεση του κλώνου +ve του γονιδίου προς την κατεύθυνση 5' προς 3'. Ο αντίστροφος εκκινητής ανόπτεται με τον κλώνο αίσθησης και ξεκινά τη σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου του κωδικοποιητικού κλώνου. που είναι –ve ο κλώνος του γονιδίου σε κατεύθυνση 5’ προς 3’. Αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ των μπροστινών και των αντίστροφων εκκινητών.
Τι είναι το Forward Primer;
Ο προσανατολισμός προς τα εμπρός είναι η σύνθεση του κωδικοποιητικού κλώνου ή του νοητηρίου κλώνου ενός γονιδίου. Η πολυμεράση Taq καταλύει τη σύνθεση ενός νέου κλώνου σε κατεύθυνση 5' προς 3'. Η σύνθεση του κωδικοποιητικού κλώνου συμβαίνει όταν ο εκκινητής ανόπτεται με τον μη κωδικοποιητικό ή αντιπληροφοριακό κλώνο και επιμηκύνεται σε κατεύθυνση 5' προς 3'.
Εικόνα 01: Εμπρός και αντίστροφα αστάρια
Ο εκκινητής που ανόπτεται με τον αντιπληροφοριακό κλώνο ή τον μη κωδικοποιητικό κλώνο ή τον κλώνο μήτρας είναι γνωστός ως εμπρόσθιος εκκινητής αφού ο εμπρόσθιος εκκινητής δρα ως αφετηρία για τη σύνθεση της κωδικοποίησης ή του θετικού κλώνου του γονιδίου. Ο μπροστινός εκκινητής έχει μια σύντομη αλληλουχία νουκλεοτιδίων που είναι συμπληρωματική προς το 3' πλευρικό άκρο του αντιπληροφοριακού κλώνου. Υβριδίζεται με τον αντιπληροφοριακό κλώνο και διευκολύνει την πολυμεράση Taq να προσθέσει νουκλεοτίδια που είναι συμπληρωματικά στον κλώνο του εκμαγείου.
Τι είναι το Reverse Primer;
Ανάστροφος εκκινητής είναι η σύντομη αλληλουχία DNA που ανόπτεται με το 3' άκρο του νοηματικού κλώνου ή του κωδικοποιητικού κλώνου. Ο αντίστροφος εκκινητής χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου της κωδικεύουσας αλληλουχίας ή της μη κωδικοποιητικής αλληλουχίας. Το ανάστροφο αστάρι έχει σχεδιαστεί συμπληρωματικά προς το 3' άκρο του κωδικοποιητικού κλώνου. Ως εκ τούτου, ανόπτεται με το πλευρικό άκρο 3' του κωδικοποιητικού κλώνου και επιτρέπει στην πολυμεράση Taq να συνθέσει τον αντιπληροφοριακό κλώνο ή τον κλώνο μήτρας. Δεδομένου ότι ο προσανατολισμός του είναι με αντίστροφο τρόπο, αυτό το αστάρι επισημαίνεται ως αντίστροφο αστάρι.
Τόσο οι εκκινητές ανάστροφου όσο και εμπρός είναι σημαντικοί για την παραγωγή εκατομμυρίων έως δισεκατομμυρίων αντιγράφων συγκεκριμένων περιοχών DNA που στοχεύουν ή ενδιαφέρονται.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ Forward και Reverse Primer;
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εναύσματα κατασκευάζονται από ολιγονουκλεοτίδια.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εκκινητές διαθέτουν βραχεία αλληλουχία νουκλεοτιδίων συμπληρωματική προς τα πλευρικά άκρα των διπλών κλώνων του DNA.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εναύσματα αποτελούνται συνήθως από 20 νουκλεοτίδια.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εκκινητές χρησιμοποιούνται σε αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης.
- Τόσο τα Forward όσο και τα Reverse Primers συντίθενται στο εμπόριο.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα αστάρια είναι σταθερά στη θερμοκρασία και συνήθως έχουν παρόμοια Tm.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εκκινητές ανόπτονται με τις αλληλουχίες DNA-στόχους.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εκκινητές έχουν σχεδιαστεί σύμφωνα με τις αντιδράσεις PCR.
- Τόσο τα μπροστινά όσο και τα αντίστροφα εκκινητές χρησιμεύουν ως σημεία εκκίνησης για την ενίσχυση του DNA.
- Τόσο οι αντίστροφοι όσο και οι μπροστινοί εκκινητές είναι σημαντικοί για την παραγωγή εκατομμυρίων αντιγράφων συγκεκριμένων περιοχών στοχευμένων ή ενδιαφερόμενων αλληλουχιών DNA.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Forward και Reverse Primer;
Forward Primer εναντίον Reverse Primer |
|
| Μπροστινός εκκινητής είναι η σύντομη αλληλουχία DNA που υβριδοποιείται με το 3' άκρο του μη κωδικοποιητικού ή του προτύπου κλώνου του γονιδίου και χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση της κωδικεύουσας αλληλουχίας. | Αντίστροφος εκκινητής είναι η σύντομη αλληλουχία DNA που υβριδοποιείται με το 3' άκρο του κωδικοποιητικού ή του κλώνου χωρίς πρότυπο και χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση της μη κωδικοποιητικής αλληλουχίας. |
| νήμα ανόπτησης | |
| Μπροστινά ανόπτηση ασταριού με κλώνο προτύπου. | Ανόπτηση ανάστροφου ασταριού με τον κλώνο χωρίς μήτρα. |
| Αποτέλεσμα νέας ακολουθίας | |
| Το μπροστινό εκκινητή διευκολύνει τη σύνθεση της κωδικοποιητικής αλληλουχίας. | Το αντίστροφο εκκινητή διευκολύνει τη σύνθεση της μη κωδικοποιητικής αλληλουχίας. |
Summary – Forward vs Reverse Primer
Υπάρχουν δύο τύποι εκκινητών που εμπλέκονται στην τεχνική PCR. Είναι εκκινητές προς τα εμπρός και προς τα πίσω. Με βάση την επιμήκυνση του εκκινητή στη σύνθεση νέων κλώνων DNA, αυτοί οι εκκινητές επισημαίνονται ή ονομάζονται. Η πολυμεράση Taq συνθέτει το νέο DNA σε προσανατολισμό 5' έως 3'. Ως εκ τούτου, τα αστάρια σχεδιάζονται ως συμπληρωματικά προς τα 3' άκρα των διπλών κλώνων. Ο μπροστινός εκκινητής που επιμηκύνεται σε κατεύθυνση 5' προς 3' υβριδοποιείται με το άκρο 3' του αντιπληροφοριακού ή του εκμαγείου ή της μη κωδικοποιητικής αλληλουχίας. Χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση κωδικοποιητικής ακολουθίας. Το ανάστροφο αστάρι που επιμηκύνεται σε κατεύθυνση 5' έως 3' υβριδοποιείται με το άκρο 3' του κωδικοποιητικού ή του μη εκμαγείου ή του κλώνου αίσθησης. Χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση της μη κωδικοποιητικής ακολουθίας. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ του μπροστινού και του ανάποδου ασταριού.
