Βασική διαφορά – AFLP vs RFLP
Οι μελέτες DNA έχουν τεράστια σημασία για την κατανόηση και τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων, τη διάγνωση γενετικών ασθενειών και τη χαρτογράφηση των γονιδιωμάτων του οργανισμού. Διάφορες τεχνικές που σχετίζονται με την ανάλυση DNA χρησιμοποιούνται επίσης για την ταυτοποίηση ενός συγκεκριμένου γονιδίου ή μιας αλληλουχίας DNA σε μια δεξαμενή άγνωστου DNA. Είναι γνωστοί ως μοριακοί δείκτες. Ο Ενισχυμένος πολυμορφισμός μήκους θραύσματος (AFLP) και ο πολυμορφισμός μήκους περιορισμού θραύσματος (RFLP) είναι δύο τέτοιοι μοριακοί δείκτες (μέθοδοι) που αναπτύχθηκαν στη μοριακή βιολογία για την ανίχνευση γενετικών διαφορών μεταξύ των οργανισμών. Και οι δύο μέθοδοι είναι εξίσου σημαντικές και έχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Η βασική διαφορά μεταξύ AFLP και RFLP είναι ότι το AFLP περιλαμβάνει επιλεκτική ενίσχυση PCR του DNA που έχει υποστεί πέψη, ενώ το RFLP δεν περιλαμβάνει επιλεκτική ενίσχυση PCR των θραυσμάτων DNA.
Τι είναι το AFLP;
Το AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) είναι ένα σημαντικό εργαλείο στη μοριακή βιολογία και χρησιμοποιείται ευρέως στην ανάλυση γενετικών παραλλαγών. Το AFLP βασίζεται στην ειδική ενίσχυση PCR του κατακερματισμένου γονιδιωματικού DNA και στην ανίχνευση του πολυμορφισμού με αυτοραδιογραφίες μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης. Το AFLP συμβάλλει ευρέως στον εντοπισμό γενετικών διαφορών σε στελέχη ή στενά συγγενικά είδη διαφόρων βασιλείων, συμπεριλαμβανομένων φυτών, ζώων, βακτηρίων και μυκήτων. Το AFLP μπορεί να πραγματοποιηθεί με μικρές ποσότητες άγνωστων δειγμάτων DNA. Δεν απαιτεί προηγούμενη γνώση ακολουθίας και σχεδιασμό ανιχνευτών.
Βήματα AFLP
- Απομόνωση DNA
- Πέψη του DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες
- Σύνδεση των περιορισμένων θραυσμάτων DNA με προσαρμογείς
- Επιλεκτική ενίσχυση των θραυσμάτων με συγκεκριμένες θέσεις περιορισμού
- Διαχωρισμός των προϊόντων PCR με ηλεκτροφόρηση γέλης
- Οπτικοποίηση της μήτρας γέλης με αυτοραδιογράφο
Το AFLP είναι μια πιο ευαίσθητη και αναπαραγώγιμη μέθοδος που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο προφίλ DNA πολλών ταξινομικών ομάδων, συμπεριλαμβανομένων μυκήτων, βακτηρίων, φυτών και ζώων χωρίς προηγούμενη γνώση των αλληλουχιών DNA. Βοηθά στον εντοπισμό μικρών διαφορών μεταξύ των ατόμων στους πληθυσμούς λόγω της εξαιρετικά ευαίσθητης φύσης του. Το AFLP είναι επίσης σημαντικό στη χαρτογράφηση του γονιδιώματος, τις ιατροδικαστικές μελέτες, τον γονικό έλεγχο, τον προσδιορισμό γονότυπου κ.λπ.
Εικόνα 01: AFLP
Τι είναι το RFLP;
Οι πολυμορφισμοί μήκους θραύσματος περιορισμού (RFLPs) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των γενετικών παραλλαγών σε ομόλογες αλληλουχίες DNA. Είναι η πρώτη μέθοδος που αναπτύχθηκε για τη δημιουργία προφίλ DNA. Οι οργανισμοί έχουν μοναδικά δακτυλικά αποτυπώματα DNA ή προφίλ DNA. Το RFLP χρησιμεύει ως σημαντικό εργαλείο για την ανάλυση της διακύμανσης μεταξύ των προφίλ DNA ενδοειδικών ή στενά συγγενών οργανισμών, καθώς οι ομόλογες αλληλουχίες έχουν διαφορετικές θέσεις περιορισμού (θέσεις) που είναι μοναδικές για έναν συγκεκριμένο οργανισμό. Όταν το ομόλογο DNA υποβάλλεται σε πέψη με ειδικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες, θα έχει ως αποτέλεσμα διαφορετικά προφίλ DNA που είναι μοναδικά για κάθε άτομο. Επομένως, η αρχή αυτής της μεθόδου είναι η ανίχνευση γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των οργανισμών με περιορισμό του ομόλογου DNA με ειδικά περιοριστικά ένζυμα και ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους θραύσματος μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής και στύπωσης. Τα σχέδια στύπωσης είναι μοναδικά για κάθε οργανισμό και χαρακτηρίζουν τους συγκεκριμένους γονότυπους.
Βήματα RFLP
- Απομόνωση επαρκούς ποσότητας DNA από δείγματα
- Κατακερματισμός των δειγμάτων DNA με ειδικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες σε σύντομη αλληλουχία
- Διαχωρισμός των θραυσμάτων που προέκυψαν με διαφορετικά μήκη με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.
- Μεταφορά του προφίλ γέλης σε μεμβράνη με στύπωμα Southern
- Υβριδισμός της μεμβράνης με επισημασμένους ανιχνευτές και ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους θραύσματος σε κάθε προφίλ
Το RFLP είναι μια πολύ σημαντική τεχνική για την ανίχνευση της κληρονομικότητας της νόσου και την εύρεση του κινδύνου εμφάνισης της νόσου μεταξύ των μελών της οικογένειας. Το RFLP χρησιμοποιείται επίσης συχνά στη χαρτογράφηση του γονιδιώματος, στον εντοπισμό εγκληματιών στην εγκληματολογία, στον έλεγχο πατρότητας κ.λπ. Το RFLP έχει επίσης αρκετούς περιορισμούς. Το RFLP απαιτεί την προηγούμενη γνώση των δεδομένων αλληλουχίας για τον σχεδιασμό ανιχνευτών για υβριδισμό. Απαιτεί επίσης απομόνωση επαρκούς ποσότητας DNA από το δείγμα για ανάλυση, κάτι που είναι δύσκολο στις ιατροδικαστικές μελέτες.
Εικόνα 01: Αντιστοίχιση RRFLP
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ AFLP και RFLP;
ALFP vs RFLP |
|
| Το AFLP περιλαμβάνει επιλεκτική ενίσχυση PCR του DNA που έχει υποστεί πέψη. | Το RFLP δεν περιλαμβάνει PCR εκτός εάν είναι PCR-RFLP. |
| Γνώσεις ακολουθίας | |
| Δεν απαιτείται προηγούμενη γνώση ακολουθίας. | Απαιτείται προηγούμενη γνώση ακολουθίας για τον σχεδιασμό ανιχνευτών RFLP. |
| Αξιοπιστία | |
| Αυτό είναι πιο αξιόπιστο. | Αυτό είναι λιγότερο αξιόπιστο σε σύγκριση με το AFLP. |
| Αποτελεσματικότητα στην ανίχνευση πολυμορφισμού | |
| Αυτό έχει υψηλότερη αποτελεσματικότητα στην ανίχνευση πολυμορφισμού από το RFLP. | Αυτό είναι λιγότερο αποτελεσματικό σε σύγκριση με το AFLP. |
| Κόστος | |
| Αυτό είναι λίγο ακριβό σε σύγκριση με το RFLP. | Αυτό είναι λιγότερο ακριβό σε σύγκριση με το AFLP. |
| Εφαρμογές | |
| Τα AFLP έχουν εφαρμοστεί στη χαρτογράφηση γονιδιώματος, τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA, τις μελέτες γενετικής ποικιλότητας, τον έλεγχο πατρότητας και την εγκληματολογία | Η ανάλυση RFLP είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος, τον εντοπισμό γονιδίων για γενετικές διαταραχές, τον προσδιορισμό του κινδύνου για ασθένεια και τον έλεγχο πατρότητας. |
Σύνοψη – AFLP vs RFLP
AFLP και RFLP είναι δύο τεχνικές που χρησιμοποιούνται ως γενετικοί δείκτες για την αξιολόγηση της διαφορετικότητας και την αξιολόγηση των γενετικών σχέσεων στη μοριακή βιολογία. Το AFLP χρησιμεύει ως αποτελεσματική και ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση γενετικού πολυμορφισμού μεταξύ οργανισμών από το RFLP. Ωστόσο, αν και και οι δύο αυτές μέθοδοι έχουν διαφορετική αποτελεσματικότητα στην ανίχνευση γενετικών παραλλαγών, εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται για τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA και τη διάγνωση ασθενειών.
