Βασική διαφορά – RAPD εναντίον RFLP
Οι γενετικοί δείκτες χρησιμοποιούνται στη Μοριακή Βιολογία για τον εντοπισμό γενετικών παραλλαγών μεταξύ ατόμων και ειδών. Το Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) και ο Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) είναι δύο σημαντικοί μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιούνται συνήθως στα εργαστήρια. Το RAPD εκτελείται με βραχείς και αυθαίρετους ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές και βασίζεται στην τυχαία ενίσχυση των πολλαπλών θέσεων σε όλο το πρότυπο DNA του οργανισμού. Το RFLP εκτελείται με μια ειδική περιοριστική ενδονουκλεάση και βασίζεται στον πολυμορφισμό των προκύπτων περιοριστικών θραυσμάτων και στον υβριδισμό. Η βασική διαφορά μεταξύ RAPL και RFLP είναι ότι η RAPD είναι ένας τύπος τεχνικής PCR που εκτελείται χωρίς προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας, ενώ το RFLP δεν εμπλέκεται στην PCR και απαιτεί προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας για την εκτέλεση της τεχνικής.
Τι είναι το RAPD;
Το RAPD είναι ένας χρήσιμος μοριακός δείκτης στη μοριακή βιολογία. Είναι μια γρήγορη και εύκολη τεχνική. Η RAPD μπορεί να οριστεί ως μια μέθοδος που οδηγεί σε πολυμορφικές αλληλουχίες DNA ως αποτέλεσμα τυχαίας ενίσχυσης πολλαπλών θέσεων του προτύπου DNA στόχου. Το RAPD χρησιμοποιεί βραχείς ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές με αυθαίρετες αλληλουχίες για την ενίσχυση PCR. Οι εκκινητές συντίθενται τεχνητά χωρίς την προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας. Ως εκ τούτου, θεωρείται ως μια εύκολη και χρήσιμη τεχνική.
Τα ακόλουθα σημαντικά βήματα εμπλέκονται στο RAPD.
- Εξαγωγή DNA στόχου
- Ενίσχυση των πολλαπλών θέσεων του DNA στόχου χρησιμοποιώντας τυχαία επιλεγμένους εκκινητές
- Ηλεκτροφόρηση γέλης των ενισχυμένων προϊόντων PCR
- Χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και ταυτοποίηση του πολυμορφισμού
Ως αποτέλεσμα της διακύμανσης στην ανόπτηση του εκκινητή, δημιουργούνται διαφορετικά θραύσματα με διαφορετικά μήκη κατά την ενίσχυση. Ως εκ τούτου, τα σχέδια ζωνών στα πηκτώματα είναι διαφορετικά μεταξύ ατόμων και ειδών. Έτσι, η RAPD επιτρέπει την ανίχνευση γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των οργανισμών στην αναγνώριση και διαφοροποίηση.
Το RAPD εφαρμόζεται σε διάφορες μελέτες μοριακής βιολογίας, όπως η αναγνώριση της γενετικής διαφοράς μεταξύ στενά συγγενών ειδών, η χαρτογράφηση γονιδίων, η λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA, η αναγνώριση κληρονομικών ασθενειών κ.λπ.
Εικόνα 01: RAPD
Τι είναι το RFLP;
Οι πολυμορφισμοί μήκους θραύσματος περιορισμού (RFLPs) είναι ένας μοριακός δείκτης που χρησιμοποιείται στη μοριακή βιολογία για την αναγνώριση γενετικής διαφοροποίησης σε ομόλογες αλληλουχίες DNA. Είναι ο πρώτος γενετικός δείκτης που αναπτύχθηκε για τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA. Όλοι οι οργανισμοί παράγουν μοναδικά προφίλ DNA όταν περιορίζονται με συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού. Το RFLP χρησιμεύει ως σημαντικό εργαλείο για την παραγωγή μοναδικών προφίλ DNA ατόμων και την ανίχνευση γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ τους. Όταν τα δείγματα DNA υποβάλλονται σε πέψη με ειδικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες, αποδίδει διαφορετικά προφίλ DNA που είναι μοναδικά για κάθε άτομο. Επομένως, η αρχή αυτής της μεθόδου είναι η ανίχνευση γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των οργανισμών με περιορισμό του ομόλογου DNA με ειδικά περιοριστικά ένζυμα και ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους θραύσματος μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής και στύπωσης. Τα σχέδια στύπωσης είναι μοναδικά για κάθε οργανισμό και χαρακτηρίζουν τους συγκεκριμένους γονότυπους.
Τα ακόλουθα βήματα αφορούν το RFLP.
- Απομόνωση επαρκούς ποσότητας DNA από δείγματα
- Κατακερματισμός των δειγμάτων DNA με ειδικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες σε σύντομη αλληλουχία
- Διαχωρισμός των θραυσμάτων που προέκυψαν με διαφορετικά μήκη με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.
- Μεταφορά του προφίλ γέλης σε μεμβράνη με στύπωμα Southern
- Υβριδισμός της μεμβράνης με επισημασμένους ανιχνευτές και ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους θραύσματος σε κάθε προφίλ
Το RFLP έχει διάφορες εφαρμογές όπως διάγνωση κληρονομικών ασθενειών, χαρτογράφηση γονιδιώματος, εγκληματική ταυτοποίηση σε ιατροδικαστικές μελέτες, τεστ πατρότητας κ.λπ.
Εικόνα 02: Γονοτυποποίηση RFLP
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ RAPD και RFLP;
RAPD εναντίον RFLP |
|
| Το RAPD είναι ένας μοριακός δείκτης που βασίζεται σε τυχαίους εκκινητές και PCR. | Το RFLP είναι ένας μοριακός δείκτης που βασίζεται στην παραγωγή διαφορετικών θραυσμάτων περιορισμού μήκους. |
| Απαιτούμενο δείγμα | |
| Μικρά δείγματα DNA είναι αρκετά για την ανάλυση RAPD. | Απαιτείται μεγάλη ποσότητα δείγματος εξαγωγής DNA για την ανάλυση RFLP. |
| Ώρα | |
| RAPD είναι μια γρήγορη διαδικασία. | RFLP είναι μια χρονοβόρα διαδικασία. |
| Primer Use | |
| Χρησιμοποιούνται τυχαίες εκκινητές και μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι ίδιοι εκκινητές για διαφορετικά είδη. | Ειδικοί ανιχνευτές χρησιμοποιούνται στο RFLP για υβριδισμό. |
| Αξιοπιστία | |
| Η αξιοπιστία της τεχνικής είναι μικρότερη σε σύγκριση με το RFLP. | Το RFLP είναι μια αξιόπιστη τεχνική. |
| Blotting | |
| RAPD περιλαμβάνει νότιο στύπωμα. | Το νότιο στύπωμα είναι ένα βήμα του RFLP. |
| Ανίχνευση αλληλικής παραλλαγής | |
| Αλληλικές παραλλαγές δεν μπορούν να εντοπιστούν από το RAPD. | Αλληλικές παραλλαγές μπορούν να ανιχνευθούν με RFLP. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| Το RAPD δεν απαιτεί προηγούμενη γνώση ακολουθίας. | Απαιτούνται προηγούμενες γνώσεις ακολουθίας για το σχεδιασμό ανιχνευτή. |
| PCR | |
| PCR εμπλέκεται με RAPD | PCR δεν εμπλέκεται με RFLP. |
| Αναπαραγωγιμότητα | |
| RAPD έχει χαμηλή αναπαραγωγιμότητα | Το RFLP έχει υψηλή αναπαραγωγιμότητα σε σύγκριση με το RAPD. |
Σύνοψη – RAPD εναντίον RFLP
RAPD και RFLP είναι σημαντικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία. Και οι δύο μέθοδοι είναι ικανές να ανιχνεύσουν γενετικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των οργανισμών. Η RAPD εκτελείται χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές. Το RFLP εκτελείται χρησιμοποιώντας ειδικά ένζυμα περιορισμού. Και οι δύο μέθοδοι παράγουν προφίλ DNA μοναδικά για μεμονωμένους οργανισμούς. Το RAPD περιλαμβάνει σχετικά λίγα βήματα από το RFLP. Αλλά παράγει λιγότερο αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα από το RFLP. Αυτή είναι η κύρια διαφορά μεταξύ RAPD και RFLP.
