Βασική διαφορά – PCR έναντι αντιγραφής DNA
Η αντιγραφή DNA είναι μια φυσική διαδικασία που συμβαίνει σε ζωντανούς οργανισμούς. Περιλαμβάνει την παραγωγή δύο πανομοιότυπων αντιγράφων ενός μορίου DNA. Η αντιγραφή του DNA είναι μια εξαιρετικά σημαντική διαδικασία βιολογικής κληρονομικότητας. Η γενετική πληροφορία μεταβιβάζεται από τον γονέα στους απογόνους κυρίως λόγω της ικανότητας αντιγραφής του DNA. Ως εκ τούτου, είναι μια ουσιαστική διαδικασία που συμβαίνει σε όλους σχεδόν τους ζωντανούς οργανισμούς. Αυτή η διαδικασία συμβαίνει in vivo. Ωστόσο, η αντιγραφή του DNA μπορεί να γίνει και με μεθόδους in vitro. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια τέτοια in vitro μέθοδος αντιγραφής του DNA. Η PCR είναι μια μέθοδος ενίσχυσης DNA που πραγματοποιείται σε εργαστήρια. Παράγει χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα DNA από ένα ενδιαφερόμενο θραύσμα DNA ή ένα γονίδιο. Υπάρχουν διαφορές μεταξύ της in vivo αντιγραφής DNA και της PCR. Η βασική διαφορά μεταξύ αυτών των δύο είναι ότι η PCR εκτελείται σε μια μηχανή PCR σε διατηρούμενες θερμοκρασίες για την παραγωγή μεγάλου αριθμού αντιγράφων DNA, ενώ η αντιγραφή DNA λαμβάνει χώρα μέσα στο σώμα σε θερμοκρασία σώματος για να παραχθούν δύο πανομοιότυπα αντίγραφα ενός μόνο μορίου DNA.
Τι είναι η PCR;
Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) είναι μια τεχνική ενίσχυσης DNA in vitro που εκτελείται τακτικά σε εργαστήρια Μοριακής Βιολογίας. Αυτή η μέθοδος επέτρεψε την παραγωγή χιλιάδων έως εκατομμυρίων αντιγράφων ενός ιδιαίτερα ενδιαφέροντος θραύσματος DNA. Η PCR εισήχθη από τον Kary Mullis το 1980. Σε αυτή την τεχνική, το ενδιαφέρον θραύσμα DNA χρησιμεύει ως πρότυπο για τη δημιουργία αντιγράφων. Το ένζυμο που ονομάζεται πολυμεράση Taq χρησιμοποιείται ως ένζυμο πολυμεράσης DNA και θα καταλύσει τη σύνθεση νέων κλώνων του θραύσματος DNA. Οι εκκινητές που βρίσκονται στο μείγμα PCR θα λειτουργήσουν ως σημεία εκκίνησης για τις επεκτάσεις θραυσμάτων. Στο τέλος της αντίδρασης PCR, μπορούν να ληφθούν πολλά αντίγραφα του δείγματος DNA.
Όλα τα συστατικά που είναι απαραίτητα για τη δημιουργία αντιγράφων του DNA περιλαμβάνονται στο μείγμα PCR. Είναι δείγμα DNA, DNA πολυμεράση (Taq πολυμεράση), εκκινητές (εμπρός και ανάστροφος εκκινητές), νουκλεοτίδια (δομικά στοιχεία του DNA) και ένα ρυθμιστικό διάλυμα. Η αντίδραση PCR εκτελείται σε μηχανή PCR και θα πρέπει να τροφοδοτηθεί με το σωστό μείγμα PCR και το σωστό πρόγραμμα PCR. Εάν το μείγμα αντίδρασης και το πρόγραμμα είναι σωστά, θα παράγει την απαιτούμενη ποσότητα αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA από μια πολύ μικρή ποσότητα DNA.
Υπάρχουν τρία βασικά στάδια που εμπλέκονται σε μια αντίδραση PCR: μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητή και επέκταση κλώνου. Αυτά τα τρία βήματα συμβαίνουν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. Το DNA υπάρχει ως δίκλωνη έλικα. Δύο κλώνοι συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου. Πριν από την ενίσχυση, το δίκλωνο DNA διαχωρίζεται δίνοντας υψηλή θερμοκρασία. Σε υψηλή θερμοκρασία, το δίκλωνο DNA μετουσιώθηκε σε μονούς κλώνους. Στη συνέχεια, οι εκκινητές ανόπτονται με τα πλευρικά άκρα του ενδιαφερόμενου θραύσματος ή του γονιδίου του DNA. Το Primer είναι ένα σύντομο κομμάτι μονόκλωνου DNA που είναι συμπληρωματικό στα άκρα της αλληλουχίας στόχου. Τα μπροστινά και τα αντίστροφα εκκινητές ανόπτονται με τις συμπληρωματικές βάσεις στα πλευρικά άκρα του μετουσιωμένου δείγματος DNA στη θερμοκρασία ανόπτησης.
Όταν οι εκκινητές ανόπτονται με DNA, το ένζυμο πολυμεράσης Taq ξεκινά τη σύνθεση των νέων κλώνων προσθέτοντας νουκλεοτίδια που είναι συμπληρωματικά στο πρότυπο DNA. Η πολυμεράση Taq είναι ένα θερμοσταθερό ένζυμο που απομονώνεται από ένα θερμόφιλο βακτήριο που ονομάζεται Thermus aquaticus. Το ρυθμιστικό PCR διατηρεί τις βέλτιστες συνθήκες για τη δράση της πολυμεράσης Taq. Αυτά τα τρία στάδια αντίδρασης PCR επαναλαμβάνονται για να παραχθεί η απαιτούμενη ποσότητα του προϊόντος PCR. Σε κάθε αντίδραση PCR, ο αριθμός του αντιγράφου DNA διπλασιάζεται. Ως εκ τούτου, μια εκθετική ενίσχυση μπορεί να παρατηρηθεί στην PCR. Το προϊόν PCR μπορεί να παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης, καθώς παράγει την ορατή ποσότητα DNA σε ένα πήκτωμα και μπορεί να καθαριστεί για περαιτέρω μελέτες, όπως προσδιορισμό αλληλουχίας κ.λπ.
Εικόνα 01: PCR
Η PCR είναι ένα πολύτιμο εργαλείο στην ιατρική και βιολογική έρευνα. Ειδικά στις εγκληματολογικές μελέτες, η PCR έχει τεράστια αξία αφού μπορεί να ενισχύσει το DNA για μελέτες από τα μικροσκοπικά δείγματα των εγκληματιών και να δημιουργήσει ιατροδικαστικά προφίλ DNA. Η PCR χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς τομείς της Μοριακής Βιολογίας, συμπεριλαμβανομένου του γονότυπου, της κλωνοποίησης γονιδίων, της ανίχνευσης μεταλλάξεων, της αλληλουχίας DNA, των μικροσυστοιχιών DNA και του τεστ πατρότητας κ.λπ.
Τι είναι η αντιγραφή DNA;
Η αντιγραφή DNA αναφέρεται στη διαδικασία που παράγει δύο πανομοιότυπα αντίγραφα DNA από ένα μόριο DNA. Είναι μια σημαντική διαδικασία βιολογικής κληρονομικότητας. Η αντιγραφή του DNA συμβαίνει σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Το γονιδίωμα του γονικού κυττάρου θα πρέπει να αντιγραφεί για να παραδοθεί το γονιδίωμα στο θυγατρικό κύτταρο. Η διαδικασία αντιγραφής του DNA έχει τρία κύρια στάδια που ονομάζονται έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμός. Αυτά τα βήματα καταλύονται από διαφορετικά ένζυμα. Η αντιγραφή του DNA ξεκινά από τη θέση που ονομάζεται αρχή αντιγραφής στο γονιδίωμα των κυττάρων. Στο γονιδίωμα, το DNA υπάρχει σε δίκλωνη μορφή. Αυτοί οι δύο κλώνοι διαχωρίζονται στην αρχή της αντιγραφής του DNA και αυτό γίνεται από ελικάση DNA εξαρτώμενη από ΑΤΡ. Το ξετύλιγμα του DNA είναι το κύριο γεγονός που συμβαίνει στο στάδιο της έναρξης. Χρησιμοποιώντας διαχωρισμένους κλώνους DNA ως εκμαγεία, η πολυμεράση DNA συνθέτει τους νέους συμπληρωματικούς κλώνους των κλώνων του εκμαγείου σε κατεύθυνση 5' προς 3'. Αυτό είναι το βήμα που ονομάζεται επιμήκυνση. Ο τερματισμός συμβαίνει όταν οι δύο διχάλες αντιγραφής συναντώνται μεταξύ τους στο αντίθετο άκρο του γονικού χρωμοσώματος.
Εικόνα 02: Αντιγραφή DNA
Εκτός από την DNA πολυμεράση, πολλά ένζυμα όπως η πριμάση του DNA, η ελικάση DNA, η λιγάση DNA και η τοποϊσομεράση εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της in vivo αντιγραφής του DNA είναι ότι παράγει θραύσματα Okazaki. Το ένα σκέλος σχηματίζεται συνεχώς ενώ το άλλο σε μικρά κομμάτια.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ της PCR και της αντιγραφής DNA;
- Στην PCR και στην αντιγραφή του DNA, το δίκλωνο DNA διαχωρίζεται το ένα από το άλλο.
- Στις διαδικασίες PCR και αντιγραφής DNA, το DNA αντιγράφεται.
- Τόσο οι διαδικασίες PCR όσο και οι διαδικασίες αντιγραφής DNA είναι πολύ σημαντικές.
- Σε διεργασίες PCR και αντιγραφής DNA, εμπλέκεται το ένζυμο DNA πολυμεράσης.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ PCR και αντιγραφής DNA;
PCR έναντι αντιγραφής DNA |
|
| Η PCR είναι μια in vitro μέθοδος ενίσχυσης DNA στην οποία παράγονται χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα DNA. | Ο αναδιπλασιασμός του DNA είναι μια φυσική διαδικασία που παράγει δύο πανομοιότυπα αντίγραφα DNA από ένα μόριο DNA. |
| Βήματα | |
| Η PCR έχει τρία βήματα. μετουσίωση, ανόπτηση ασταριού και επέκταση κλώνου. | Η αντιγραφή DNA έχει τρία βήματα. έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμός. |
| Συμμετοχή Primers | |
| Η PCR χρειάζεται τεχνητούς εκκινητές. | Η αντιγραφή DNA δεν χρειάζεται τεχνητά εκκινητές. Ένα σύντομο θραύσμα RNA εμπλέκεται στην αντιγραφή του DNA. |
| Μετουσίωση των διπλών κλώνων | |
| Οι διπλοί κλώνοι διαχωρίζονται με εφαρμογή υψηλής θερμοκρασίας σε PCR. | Οι διπλοί κλώνοι διαχωρίζονται μεταξύ τους από το ένζυμο ελικάση DNA στην αντιγραφή DNA. |
| Ένζυμο που εμπλέκεται | |
| PCR χρησιμοποιεί πολυμεράση Taq. | Η αντιγραφή DNA χρησιμοποιεί πολυμεράση DNA. |
| Θερμοκρασία | |
| PCR συμβαίνει σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες μέσα σε ένα μηχάνημα. | Ο αναδιπλασιασμός του DNA συμβαίνει στη θερμοκρασία του σώματος μέσα στο σώμα του ζωντανού οργανισμού. |
| In vivo ή In vitro | |
| Η PCR είναι μέθοδος in vitro. | Η αντιγραφή DNA είναι μέθοδος in vivo. |
Σύνοψη – PCR έναντι αντιγραφής DNA
Η αντιγραφή DNA είναι μια διαδικασία παραγωγής δύο πανομοιότυπων αντιγράφων DNA από ένα μόνο μόριο DNA. Εμφανίζεται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς αφού προσφέρει μια μέθοδο παροχής γενετικών πληροφοριών από τον γονέα στους απογόνους. Αποτελείται από τρία ενζυματικά καταλυόμενα στάδια, δηλαδή την έναρξη, την επιμήκυνση και τον τερματισμό. Η αντιγραφή του DNA μπορεί να γίνει τεχνητά στο εργαστήριο. Η PCR είναι ένας τρόπος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων DNA από το ενδιαφερόμενο DNA. Η PCR πραγματοποιείται τακτικά σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας, καθώς είναι μια εύκολη μέθοδος παραγωγής αντιγράφων DNA. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ PCR και αντιγραφής DNA.
