Η βασική διαφορά μεταξύ του Golden Gate και του Gibson Assembly είναι ότι το Golden Gate βασίζεται στην παρουσία θέσεων περιορισμού σε μια συγκεκριμένη ακολουθία που πρόκειται να κλωνοποιηθεί, ενώ το Gibson Assembly δεν βασίζεται στην παρουσία θέσεων περιορισμού σε μια συγκεκριμένη ακολουθία να κλωνοποιηθεί.
Τις τελευταίες δεκαετίες, μοριακοί επιστήμονες έχουν αναπτύξει διάφορες τυποποιημένες διαδικασίες που επιτρέπουν την ευκολότερη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα ενιαίο κομμάτι. Ως εκ τούτου, οι μέθοδοι κλωνοποίησης όπως η απολίνωση με περιοριστικά ένζυμα, η κλωνοποίηση πύλης, η συναρμολόγηση Gibson, η συναρμολόγηση Golden Gate και η κλωνοποίηση TOPO χρησιμοποιούνται ευρέως από ερευνητές σε επιστημονικά πειράματα. Επομένως, το Golden Gate και το Gibson Assembly είναι δύο μέθοδοι μοριακής κλωνοποίησης που επιτρέπουν τη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα μόνο κομμάτι.
Τι είναι η συνέλευση Golden Gate;
Το Golden Gate είναι μια μέθοδος μοριακής κλωνοποίησης που διευκολύνει τη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα ενιαίο κομμάτι. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην παρουσία θέσεων περιορισμού εντός μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Ξεκίνησε το 1996. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί περιοριστικά ένζυμα τύπου IIS και Τ4 DNA λιγάση. Αυτά τα ένζυμα κόβουν το DNA έξω από τις θέσεις αναγνώρισης. Μπορούν να δημιουργήσουν μη παλινδρομικές προεξοχές. Επομένως, πολλά θραύσματα DNA μπορούν να συναρμολογηθούν χρησιμοποιώντας συνδυασμούς αλληλουχιών προεξοχής.
Εικόνα 01: Golden Gate
Διαδικασία συναρμολόγησης Golden Gate
Η τεχνική Golden Gate έχει τρία βασικά βήματα στη διαδικασία της:
- δημιουργία προεξοχών στον φορέα κλωνοποίησης,
- συναρμολόγηση πολλαπλών ενθέτων DNA με χρήση ειδικών για θραύσματα αλληλουχιών σε προεξοχές και
- ligation.
Η συναρμολόγηση Golden Gate χρησιμοποιεί διανύσματα κυκλικής κλωνοποίησης (διάνυσμα προορισμού). Περαιτέρω, σε αυτή τη μέθοδο, η θέση περιορισμού εξαλείφεται από το απολινωμένο προϊόν προκειμένου να πραγματοποιηθεί πέψη και απολίνωση ταυτόχρονα. Ένα τυπικό πρωτόκολλο θερμικού κύκλου για το Golden Gate ταλαντώνεται μεταξύ 37 °C και 16 °C επειδή οι 37 °C είναι βέλτιστοι για τα ένζυμα περιορισμού και οι 16 °C είναι οι βέλτιστοι για τις λιγάσες.
Τι είναι το Gibson Assembly;
Το Gibson Assembly είναι μια μέθοδος μοριακής κλωνοποίησης που επιτρέπει τη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα μόνο κομμάτι. Σε αντίθεση με τη μέθοδο Golden Gate, αυτή η μέθοδος δεν βασίζεται στην παρουσία θέσεων περιορισμού σε μια συγκεκριμένη ακολουθία που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Βρέθηκε από τον Daniel G. Gibson του Ινστιτούτου J. Craig Venter. Αυτή η τεχνική είναι ένας τύπος μεθόδου κλωνοποίησης ανεξάρτητης αλληλουχίας και λιγάσης (SLIC).
Εικόνα 02: Συναρμολόγηση Gibson
Διαδικασία συναρμολόγησης Gibson
Το Gibson Assembly χρειάζεται θραύσματα DNA που περιέχουν 20-40 ζεύγη βάσεων που επικαλύπτονται με γειτονικά θραύσματα DNA. Οι επικαλύψεις προστίθενται μέσω PCR. Στη συνέχεια, αυτά τα θραύσματα DNA προστίθενται στο μείγμα Gibson maser που έχει τρία ένζυμα. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιείται υπό ισοθερμικές συνθήκες (50 °C για 1 ώρα) χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά ένζυμα: εξωνουκλεάση, DNA πολυμεράση και DNA λιγάση. Η εξωνουκλεάση μασάει πίσω το DNA από το 5' άκρο. Έτσι, δεν αναστέλλει τη δράση της πολυμεράσης και επιτρέπει στην αντίδραση να προχωρήσει σε μία μόνο διαδικασία. Οι προκύπτουσες μονόκλωνες περιοχές σε γειτονικά θραύσματα DNA μπορούν να ανόπτονται λόγω αλληλουχιών επικάλυψης. Η DNA πολυμεράση γεμίζει τα κενά προσθέτοντας νουκλεοτίδια. Τέλος, η DNA λιγάση ενώνεται ομοιοπολικά με το DNA γειτονικών τμημάτων. Κανονικά, το Gibson Assembly χρησιμοποιεί γραμμικά διανύσματα προορισμού. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος μπορεί ταυτόχρονα να συνδυάσει έως και 15 θραύσματα DNA με βάση την ομοιότητα αλληλουχίας.
Ομοιότητες μεταξύ της Golden Gate και της συναρμολόγησης Gibson
- Golden Gate και Gibson Assembly είναι δύο μέθοδοι μοριακής κλωνοποίησης.
- Και οι δύο μέθοδοι μπορούν να συναρμολογήσουν πολλά θραύσματα DNA σε ένα μόνο κομμάτι.
- Αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούν διανύσματα προορισμού.
- Και οι δύο μέθοδοι χρησιμοποιούν θερμικούς κυκλοποιητές για τη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA.
- Χρησιμοποιούνται σε κατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση.
Διαφορά μεταξύ Golden Gate και Gibson Assembly
Η Golden Gate είναι μια μέθοδος μοριακής κλωνοποίησης που χρησιμοποιείται στη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα ενιαίο κομμάτι που βασίζεται στην παρουσία περιοριστικών θέσεων σε μια συγκεκριμένη ακολουθία που πρόκειται να κλωνοποιηθεί, ενώ το Gibson Assembly είναι μια μέθοδος μοριακής κλωνοποίησης που χρησιμοποιείται στην συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα ενιαίο κομμάτι χωρίς να βασίζεται στην παρουσία περιοριστικών θέσεων εντός μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ Golden Gate και Gibson Assembly. Επιπλέον, η μέθοδος Golden Gate χρησιμοποιεί ένα κυκλικό διάνυσμα προορισμού, ενώ η μέθοδος Gibson Assembly χρησιμοποιεί ένα γραμμικό διάνυσμα προορισμών.
Το παρακάτω infographic παρουσιάζει τη διαφορά μεταξύ Golden Gate και Gibson Assembly.
Σύνοψη – Golden Gate vs Gibson Assembly
Η μοριακή κλωνοποίηση είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη συναρμολόγηση μορίων ανασυνδυασμένου DNA και την κατεύθυνση της αντιγραφής τους εντός των οργανισμών-ξενιστών. Το Golden Gate και το Gibson Assembly είναι δύο μέθοδοι μοριακής κλωνοποίησης που επιτρέπουν τη συναρμολόγηση πολλαπλών θραυσμάτων DNA σε ένα ενιαίο κομμάτι. Η μέθοδος Golden Gate βασίζεται στην παρουσία θέσεων περιορισμού μέσα σε μια συγκεκριμένη ακολουθία που πρόκειται να κλωνοποιηθεί, ενώ το Gibson Assembly δεν βασίζεται στην παρουσία θέσεων περιορισμού σε μια συγκεκριμένη ακολουθία που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Επομένως, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ της Golden Gate και της Gibson Assembly.
