Η βασική διαφορά μεταξύ τυχαίων εκκινητών και ολίγο dT είναι ότι ο τυχαίος εκκινητής είναι ένα μείγμα όλων των πιθανών αλληλουχιών ολιγονουκλεοτιδίων εξαμερών, ενώ ο εκκινητής ολίγο dT αποτελείται από ένα μονόκλωνο τμήμα 12-18 δεοξυθυμιδινών..
Η αντίστροφη μεταγραφή είναι ένας μηχανισμός στον οποίο το cDNA μπορεί να συντεθεί χρησιμοποιώντας mRNA ή οποιοδήποτε είδος RNA. Προκειμένου να παραχθεί cDNA, θα πρέπει να παρέχονται ένζυμο ανάστροφης μεταγραφάσης και άλλα απαραίτητα συστατικά, ειδικά εκμαγεία και εκκινητές. Οι εκκινητές είναι οι σύντομες αλληλουχίες DNA που έχουν σχεδιαστεί ειδικά για την ενίσχυση των αλληλουχιών στόχου. Οι τυχαίοι εκκινητές και οι εκκινητές ολίγο dT είναι δύο συνηθισμένοι τύποι εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην αντίστροφη μεταγραφή. Επομένως, ο τυχαίος εκκινητής ή ο εκκινητής ολίγο dT είναι σύντομες αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίου DNA που απαιτούνται για την ανάστροφη μεταγραφάση για την έναρξη της αντίστροφης μεταγραφής. Ανάλογα με το πρότυπο RNA, ο κατάλληλος εκκινητής μπορεί να επιλεγεί από αυτούς τους δύο τύπους εκκινητών.
Τι είναι τα Random Primers;
Ο τυχαίος εκκινητής είναι ένα μείγμα ολιγονουκλεοτιδίων που αντιπροσωπεύουν όλες τις πιθανές αλληλουχίες εξαμερών. Η αλληλουχία εκκινητών του τυχαίου εκκινητή είναι 5' – d (NNNNNN) –3' N=G, A, T ή C. Επομένως, οι τυχαίοι εκκινητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ενίσχυση μονόκλωνου DNA ή RNA από πολυμεράση DNA ή ανάστροφη μεταγραφάση, αντίστοιχα. Επιπλέον, το τυχαίο μίγμα εκκινητών είναι ικανό να ενισχύει όλες τις περιοχές του RNA για να δημιουργήσει cDNA. Έτσι, παράγει διάφορα μήκη cDNA.
Εικόνα 01: Τυχαίοι εκκινητές
Το πιο σημαντικό, το μείγμα τυχαίου ασταριού δεν δείχνει ειδικότητα προτύπου. Είναι ανίκανο να διακρίνει το mRNA και άλλα είδη RNA. Και, ανόπτεται με οποιοδήποτε είδος RNA στο δείγμα. Ωστόσο, το τυχαίο μίγμα εκκινητών είναι κατάλληλο για αντίστροφη μεταγραφή RNA χωρίς ουρές πολυ(Α), όπως rRNA, tRNA, μη κωδικοποιητικά RNA, μικρά RNA, προκαρυωτικό mRNA κ.λπ., αποικοδομημένο RNA και RNA με γνωστές δευτερεύουσες δομές.
Τι είναι το Oligo dT;
Το Oligo dT primer είναι ένα τέντωμα 12 – 18 δεοξυθυμίνης (dT). Η αλληλουχία εκκινητών μπορεί να αναπαρασταθεί ως 5'-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Χρησιμοποιείται για την παραγωγή cDNA από mRNA που περιέχει ουρά πολυ(Α). Βασικά, δρα ως εκκινητής για την αντίδραση που καταλύεται από την αντίστροφη μεταγραφάση. Κατά τη διάρκεια της αντίστροφης μεταγραφής, ο εκκινητής oligo dT ανόπτεται με την πολυ-αδενυλιωμένη ουρά που βρίσκεται στο 3' άκρο των περισσότερων ευκαρυωτικών mRNA και ξεκινά τη διαδικασία.
Εικόνα 02: Αντίστροφη μεταγραφή με χρήση εκκινητή Oligo dT
Σε αντίθεση με τον τυχαίο εκκινητή, ο εκκινητής oligo dT δεν είναι κατάλληλος για αποικοδομημένο RNA ή RNA που δεν έχουν ουρές πολυ(Α), συμπεριλαμβανομένου προκαρυωτικού RNA και microRNA.
Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ των τυχαίων εκκινητών και του Oligo dT;
- Ο τυχαίος εκκινητής και ο εκκινητής ολίγο dT είναι δύο τύποι εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην αντίστροφη μεταγραφή και τη δημιουργία cDNA.
- Η χρήση του τυχαίου εκκινητή και του εκκινητή oligo dT μαζί αυξάνει την ευαισθησία της σύνθεσης cDNA.
- Είναι μονόκλωνες βραχείες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Τυχαίων εκκινητών και Oligo dT;
Ο τυχαίος εκκινητής είναι μια σύντομη ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία που αποτελείται από μια τυχαία αλληλουχία. Εν τω μεταξύ, ο εκκινητής oligo dT είναι ένας βραχύς κλώνος που αποτελείται από 12 έως 18 δεοξυθυμιδίνες. Έτσι, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ τυχαίων εκκινητών και oligo dT. Η αλληλουχία του τυχαίου εκκινητή είναι 5' - d (NNNNNN) -3' N=G, A, T ή C. Ενώ, η αλληλουχία του εκκινητή ολίγο dT είναι 5'-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT) -3'. Επομένως, μπορούμε να το θεωρήσουμε αυτό ως μια άλλη διαφορά μεταξύ τυχαίων εκκινητών και ολίγο dT.
Επιπλέον, οι τυχαίοι εκκινητές δεν εμφανίζουν ειδικότητα προτύπου και ανόπτονται με οποιοδήποτε είδος RNA, ενώ οι εκκινητές ολίγο dT δείχνουν εξειδίκευση για πολυ(Α) ουρές ευκαρυωτικού mRNA.
Το παρακάτω infographic συνοψίζει τη διαφορά μεταξύ τυχαίων εκκινητών και oligo dT.
Σύνοψη – Random Primers vs Oligo dT
Ο τυχαίος εκκινητής και ο εκκινητής ολίγο dT είναι δύο τύποι εκκινητών που χρησιμοποιούνται στη σύνθεση cDNA. Ο τυχαίος εκκινητής αποτελείται από ένα μείγμα ολιγονουκλεοτιδίων, που αντιπροσωπεύουν όλες τις πιθανές αλληλουχίες εξαμερών, ενώ ο εκκινητής ολίγο dT είναι μια μονόκλωνη αλληλουχία από 12 έως 18 δεοξυθυμιδίνες. Έτσι, αυτή είναι η βασική διαφορά μεταξύ τυχαίων εκκινητών και oligo dT. Επιπλέον, οι εκκινητές oligo dT είναι χρήσιμοι για την πλήρους μήκους αντίστροφη μεταγραφή του RNA με ουρά πολυ(Α), ενώ οι τυχαίοι εκκινητές είναι χρήσιμοι για την αντίστροφη μεταγραφή των περισσότερων ειδών RNA, συμπεριλαμβανομένων των αποικοδομημένων RNA, RNA που δεν έχουν ουρές πολυ(Α) και RNA που περιέχουν δευτερογενείς δομές. Επομένως, ο τυχαίος εκκινητής δεν εμφανίζει ειδικότητα προτύπου, ενώ ο εκκινητής oligo dT δείχνει ειδικότητα προς ευκαρυωτικό mRNA που περιέχει πολυ(Α) ουρά.
