Βασική διαφορά – Probe vs Primer
Ο μοριακός ανιχνευτής είναι ένα μικρό θραύσμα DNA ή RNA που αναγνωρίζει τις συμπληρωματικές αλληλουχίες σε DNA ή RNA και επιτρέπει την αναγνώριση της αλληλουχίας στόχου. Το Primer είναι ένα μικρό τμήμα DNA ή RNA που χρησιμεύει ως σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση DNA. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται με τα συμπληρωματικά νουκλεοτίδια του DNA εκμαγείου ή του DNA στόχου. Ωστόσο, η βασική διαφορά μεταξύ ανιχνευτή και εκκινητή είναι ότι οι εκκινητές είναι απαραίτητοι για την αντιγραφή του DNA ενώ οι ανιχνευτές είναι απαραίτητοι για την ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών στο δείγμα DNA.
Τι είναι ένας ανιχνευτής;
Το Ο ανιχνευτής είναι ένα μικρό θραύσμα DNA ή RNA που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του DNA ή του RNA στόχου στο δείγμα με μοριακό υβριδισμό. Είναι επίσης γνωστοί ως μοριακοί δείκτες. Το μήκος του ανιχνευτή μπορεί να ποικίλλει (100 έως 1000 βάσεις) και τα νουκλεοτίδια του ανιχνευτή είναι συμπληρωματικά προς το τμήμα της αλληλουχίας στόχου. Για ευκολία ανίχνευσης, οι ανιχνευτές επισημαίνονται με ραδιενεργά ισότοπα ή με φθορίζουσες βαφές ή αντισώματα. Οι ανιχνευτές συνδέονται με τις συμπληρωματικές βάσεις της αλληλουχίας στόχου και αποκαλύπτουν την παρουσία του DNA ή RNA στόχου στο δείγμα. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι επισήμανσης των ανιχνευτών: η επισήμανση άκρου και η μετάφραση χαραγών. Οι ανιχνευτές κατηγοριοποιούνται σε διαφορετικούς τύπους, συμπεριλαμβανομένων των ανιχνευτών DNA, των ανιχνευτών RNA, των ανιχνευτών cDNa και των ανιχνευτών συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων, και παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνικές.
Οι ανιχνευτές είναι σημαντικά εργαλεία σε πολλούς μικροβιακούς και μοριακούς τομείς όπως η ιολογία, η ιατροδικαστική παθολογία, ο έλεγχος πατρότητας, το δακτυλικό αποτύπωμα DNA, η ανίχνευση γενετικών ασθενειών, το RFLP, η μοριακή κυτταρογενετική, ο in situ υβριδισμός κ.λπ.
Εικόνα 01: Ανιχνευτής με σήμανση φθορισμού που χρησιμοποιείται στο FISH για ανίχνευση παθογόνων
Τι είναι το Primer;
Το Primer είναι ένα σύντομο θραύσμα DNA ή RNA που χρησιμεύει ως εκκινητής για τη σύνθεση DNA. Το ένζυμο πολυμεράσης DNA προσθέτει νουκλεοτίδια στην ομάδα 3' ΟΗ της αλληλουχίας εκκινητών και συνθέτει τη νέα έλικα συμπληρωματική προς το πρότυπο DNA. Οι εκκινητές είναι πολύ μικρά θραύσματα με μήκος 18 έως 20 νουκλεοτίδια. Συντίθενται χημικά στο εργαστήριο για in vitro ενίσχυση DNA (PCR). Οι εκκινητές μπορούν να έχουν οποιαδήποτε αλληλουχία νουκλεοτιδίων αφού έχουν σχεδιαστεί από τον χρήστη. Συντίθενται για να ταιριάζουν με τις συμπληρωματικές βάσεις του προτύπου DNA. Επομένως, μπορεί να έχει οποιαδήποτε αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Οι εκκινητές είναι υψίστης σημασίας για την αντιγραφή του DNA, καθώς η DNA πολυμεράση δεν μπορεί να συνθέσει νέο DNA χωρίς ένα προϋπάρχον κομμάτι DNA. Κατά το σχεδιασμό των εκκινητών για PCR, πρέπει να ληφθούν υπόψη τα ακόλουθα στοιχεία:
- Οι εκκινητές θα πρέπει να περιέχουν τα συμπληρωματικά νουκλεοτίδια στο πλευρικό άκρο του DNA που θέλει να ενισχυθεί.
- Τα αστάρια θα πρέπει να έχουν θερμοκρασία τήξης μεταξύ 55 – 65 0C
- Το περιεχόμενο G και C θα πρέπει να είναι μεταξύ 50 και 60%.
Δύο εκκινητές χρησιμοποιούνται στην PCR ως προς τα εμπρός και προς τα πίσω για την αντιγραφή και των δύο κλώνων του δείγματος DNA. Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται συνήθως για την εκτέλεση PCR και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.
Εικόνα 02: ανόπτηση εκκινητών σε PCR
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Probe και Primer;
Probe vs Primer |
|
| Ο ανιχνευτής είναι ένα μικρό θραύσμα DNA/RNA που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας της αλληλουχίας στόχου σε ένα δείγμα με μοριακό υβριδισμό. | Primer είναι ένα μικρό τμήμα DNA ή RNA που χρησιμεύει ως σημείο εκκίνησης για την αντιγραφή του DNA. |
| Συνάρτηση | |
| Αυτό ανιχνεύει την παρουσία μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας στο δείγμα DNA ή RNA. | Αυτό λειτουργεί ως αφετηρία για τη σύνθεση DNA. |
| Μήκος | |
| Το μήκος μπορεί να κυμαίνεται από 100 – 1000 βάσεις | Το μήκος είναι γενικά περίπου 18 – 20 βάσεις |
| Δέσμευση με συμπληρωματική ακολουθία | |
| Ο ανιχνευτής υβριδοποιείται με τις συμπληρωματικές βάσεις της αλληλουχίας στόχου | Το primer ανόπτεται με τις συμπληρωματικές βάσεις των κλώνων DNA. |
| Ετικέτα | |
| Οι ανιχνευτές έχουν σήμανση για ευκολία ανίχνευσης | Τα αστάρια γενικά δεν φέρουν ετικέτα |
| Χρήση σε PCR | |
| Οι ανιχνευτές δεν χρησιμοποιούνται στην PCR | Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται στην PCR |
Σύνοψη – Probe vs Primer
Το Ο ανιχνευτής είναι ένα μικρό θραύσμα αλληλουχίας DNA ή RNA που μπορεί να υβριδοποιηθεί με συμπληρωματικά νουκλεοτίδια για την ανίχνευση μιας αλληλουχίας στόχου στο δείγμα. Οι ανιχνευτές επισημαίνονται ραδιενεργά, ανοσολογικά ή φθορίζοντα για να δουν την παρουσία της αλληλουχίας στόχου. Το Primer είναι ένα πολύ μικρό θραύσμα DNA ή RNA που λειτουργεί ως το σημείο εκκίνησης για την in vitro ενίσχυση του DNA. Η DNA πολυμεράση προσδιορίζει τον εκκινητή της ομάδας 3' ΟΗ και ξεκινά τη δημιουργία νέου κλώνου συμπληρωματικού προς το πρότυπο. Οι ανιχνευτές και οι εκκινητές λειτουργούν παρόμοια με υβριδισμό με συμπληρωματικά νουκλεοτίδια. Έτσι, η βασική διαφορά μεταξύ του ανιχνευτή και του ασταριού είναι η κύρια λειτουργία τους.
