Βασική διαφορά – cDNA vs Genomic Library
Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι βιβλιοθηκών DNA που κατασκευάστηκαν από επιστήμονες χρησιμοποιώντας τεχνικές γενετικής μηχανικής. Αυτές είναι η βιβλιοθήκη cDNA και η βιβλιοθήκη γονιδιώματος. Η βασική διαφορά μεταξύ cDNA και γονιδιωματικής βιβλιοθήκης είναι ότι η βιβλιοθήκη cDNA περιέχει το κλωνοποιημένο συμπληρωματικό DNA του συνολικού mRNA ενός οργανισμού ενώ η βιβλιοθήκη γονιδιωματικού DNA περιέχει τα κλωνοποιημένα θραύσματα ολόκληρου του γονιδιώματος ενός οργανισμού. Η βιβλιοθήκη γονιδιωματικού DNA είναι μεγαλύτερη από τη βιβλιοθήκη cDNA.
Τι είναι η Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη;
Μια βιβλιοθήκη γονιδιωματικού DNA είναι μια συλλογή κλώνων που φέρουν τα θραύσματα του συνολικού γονιδιωματικού DNA ενός οργανισμού. Περιέχει ολόκληρο το γονιδιωματικό DNA αυτού του οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων των κωδικοποιητικών και μη κωδικοποιητικών αλληλουχιών. Η κατασκευή μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης πραγματοποιείται με την τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA που ακολουθείται από κλωνοποίηση (γενετική μηχανική). Υπάρχουν διάφορα στάδια που εμπλέκονται στην κατασκευή όπως φαίνεται στο σχήμα 01. Η διαδικασία ξεκινά με την απομόνωση του γονιδιωματικού DNA. Χρησιμοποιώντας ένα κατάλληλο πρωτόκολλο εξαγωγής DNA, θα πρέπει να απομονωθεί το συνολικό γονιδιωματικό DNA ενός οργανισμού. Στη συνέχεια το DNA θα πρέπει να μετατραπεί σε διαχειρίσιμα μεγέθη ή σε συγκεκριμένα θραύσματα με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (ένζυμα κοπής DNA). Το τεμαχισμένο DNA θα πρέπει να εισαχθεί σε φορείς χρησιμοποιώντας λιγάσες DNA (ένζυμα σύνδεσης DNA). Ένας φορέας είναι ένας οργανισμός που αυτοαναπαράγεται. Τα πλασμίδια και οι βακτηριοφάγοι χρησιμοποιούνται συνήθως φορείς στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA. Αυτοί οι συνδεδεμένοι φορείς είναι γνωστοί ως μόρια ανασυνδυασμένου DNA αφού φέρουν τόσο δικές όσο και εισαγόμενες αλληλουχίες DNA. Ανασυνδυασμένοι φορείς προστίθενται σε ένα βακτήριο ξενιστή και γίνονται για να προσλαμβάνουν τους ανασυνδυασμένους φορείς μέσα στο βακτηριακό κύτταρο. Τα βακτήρια με ανασυνδυασμένους φορείς (πλασμίδια) θα πρέπει να αναπτύσσονται σε μέσο καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια του βακτηριακού πολλαπλασιασμού, το βακτηριακό DNA, μαζί με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια, αντιγράφουν τα γονιδιώματά τους και παράγουν κλώνους. Αυτοί οι κλώνοι περιέχουν ολόκληρο το γονιδίωμα του οργανισμού πηγής. Ως εκ τούτου, ονομάζεται γονιδιωματική βιβλιοθήκη. Τα πλασμίδια μπορούν εύκολα να διαχωριστούν από το βακτηριακό χρωμοσωμικό DNA για την κατασκευή της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης αυτού του οργανισμού. Εάν ένας συγκεκριμένος οργανισμός περιέχει ενδιαφέροντα γονίδια, είναι εύκολο να τον ανιχνεύσει στη γονιδιωματική βιβλιοθήκη με υβριδισμό χρησιμοποιώντας μοριακούς ανιχνευτές (δείκτες).
Οι γονιδιωματικές βιβλιοθήκες είναι σημαντικές για τη μελέτη της γονιδιωματικής δομής και λειτουργίας, συγκεκριμένα γονίδια, θέση γονιδίων, χαρτογράφηση γονιδίων, μεταλλάξεις, αλληλουχία γονιδίων, ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών γονιδίων κ.λπ.
Εικόνα_1: Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης
Τι είναι μια βιβλιοθήκη cDNA;
Μια βιβλιοθήκη cDNA είναι μια συλλογή κλώνων συμπληρωματικού DNA (cDNA) που συντίθεται από το συνολικό mRNA ενός οργανισμού. Η διαδικασία κατασκευής περιλαμβάνει διάφορα στάδια. Ο καθαρισμός του ολικού mRNA από έναν οργανισμό είναι το πρώτο βήμα που εμπλέκεται. Το απομονωμένο mRNA μετατρέπεται σε κλώνους cDNA με μια διαδικασία που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή. Η αντίστροφη μεταγραφή διευκολύνεται από ένα ένζυμο που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση. Χρησιμοποιεί έναν μικρό εκκινητή 3' και ξεκινά τη σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA συμπληρωματικού προς τον κλώνο mRNA του προτύπου. Το προκύπτον δίκλωνο cDNA μετατρέπεται σε μικρότερα θραύσματα χρησιμοποιώντας περιοριστικές ενδονουκλεάσες και εισάγονται σε κατάλληλους φορείς. Αυτά τα κατασκευασμένα ανασυνδυασμένα μόρια στη συνέχεια προστίθενται σε έναν οργανισμό ξενιστή και αναπτύσσονται σε ένα μέσο καλλιέργειας για την παραγωγή κλώνων. Η συλλογή κλώνων που περιέχουν θραύσματα cDNA ενός οργανισμού είναι γνωστή ως βιβλιοθήκη cDNA. Το πλήρως κομμένο ώριμο mRNA δεν περιέχει εσώνια και ρυθμιστικές περιοχές. Επομένως τα μη κωδικοποιητικά θραύσματα δεν υπάρχουν σε βιβλιοθήκες cDNA σε αντίθεση με μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη.
Οι βιβλιοθήκες cDNA είναι σημαντικές για την ανάλυση περιοχών κωδικοποίησης, γονιδιακών λειτουργιών, έκφρασης γονιδίων κ.λπ.
Εικόνα_2: Κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ cDNA και Genomic Library;
cDNA vs Γονιδιωματική βιβλιοθήκη |
|
| Η βιβλιοθήκη cDNA είναι μια συλλογή των κλώνων που φέρουν το συμπληρωματικό DNA στο mRNA ενός οργανισμού | Γονιδιωματική βιβλιοθήκη είναι μια συλλογή των κλώνων που φέρουν το συνολικό γονιδιωματικό DNA ενός οργανισμού. |
| Κωδικοποίηση εναντίον μη κωδικοποιημένων ακολουθιών | |
| Η βιβλιοθήκη cDNA περιέχει μόνο τις κωδικοποιητικές αλληλουχίες. δεν περιέχει εσώνια. | Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη αποτελείται από ολόκληρο το γονιδιωματικό DNA συμπεριλαμβανομένου του μη κωδικοποιητικού (εσωνίων και ρυθμιστικού) DNA. |
| Μέγεθος | |
| Η βιβλιοθήκη cDNA είναι μικρή. | Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη είναι μεγάλη. |
| Αρχικό Υλικό | |
| Αρχικό υλικό είναι mRNA | Η πρώτη ύλη είναι το DNA. |
| Συμμετοχή της αντίστροφης μεταγραφής. | |
| Η αντίστροφη μεταγραφή λαμβάνει χώρα στην πρώτη σύνθεση κλώνου cDNA. | Αντίστροφη μεταγραφή δεν συμβαίνει. |
Σύνοψη – cDNA και γονιδιωματική βιβλιοθήκη
Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη αντιπροσωπεύει έναν πληθυσμό κλώνων που φέρουν το κατακερματισμένο συνολικό γονιδιωματικό DNA ενός οργανισμού. Η βιβλιοθήκη cDNA αντιπροσωπεύει τον πληθυσμό των κλώνων που φέρουν συμπληρωματικό DNA του συνολικού mRNA ενός οργανισμού. Ένας κλώνος cDNA περιέχει μόνο τις αλληλουχίες που βρίσκονται στο mRNA ενώ ο γονιδιωματικός κλώνος περιέχει τις αλληλουχίες ολόκληρου του γονιδιώματος. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ cDNA και γονιδιωματικής βιβλιοθήκης.
