Βασική διαφορά – Κλωνοποίηση γονιδίων έναντι PCR
Η σύνθεση πολλών αντιγράφων DNA από ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA ονομάζεται ενίσχυση DNA. Υπάρχουν δύο κύριες διαδικασίες ενίσχυσης του DNA, δηλαδή η κλωνοποίηση γονιδίων και η PCR. Η βασική διαφορά μεταξύ της κλωνοποίησης γονιδίων και της PCR είναι ότι η κλωνοποίηση γονιδίων παράγει τα πολλαπλά αντίγραφα ενός συγκεκριμένου γονιδίου in vivo με την κατασκευή ενός ανασυνδυασμένου DNA και την ανάπτυξη μέσα σε ένα βακτήριο ξενιστή, ενώ η PCR παράγει εκατομμύρια αντίγραφα ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA in vitro που υποβάλλονται σε επαναλαμβανόμενους κύκλους μετουσίωση και σύνθεση.
Τι είναι η Κλωνοποίηση Γονιδίων;
Η κλωνοποίηση γονιδίων είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό και τον πολλαπλασιασμό ενός συγκεκριμένου γονιδίου από το εξαγόμενο γονιδιωματικό DNA ενός οργανισμού μέσω της κατασκευής ανασυνδυασμένου DNA. Το γονιδιωματικό DNA περιέχει χιλιάδες διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούνται για πρωτεΐνες. Όταν το DNA εξάγεται, περιλαμβάνει όλα τα πιθανά γονίδια που μπορεί να φέρει. Η τεχνική κλωνοποίησης γονιδίων επέτρεψε την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου γονιδίου από το συνολικό DNA. Ως εκ τούτου, η κλωνοποίηση γονιδίων χρησιμεύει ως ένα σημαντικό εργαλείο στη μοριακή βιολογία.
Η δημιουργία μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης ενός οργανισμού είναι απαραίτητη για την κλωνοποίηση γονιδίων εάν δεν υπάρχει ένδειξη για τη θέση του σχετικού γονιδίου στο DNA. Μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη δημιουργείται χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα βήματα.
Βήμα 1: Εξαγωγή του συνολικού DNA από έναν οργανισμό που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο.
Βήμα 2: Πέψη περιορισμού του εξαγόμενου DNA για παραγωγή μικρών διαχειρίσιμων θραυσμάτων. Αυτό το βήμα διευκολύνεται από περιοριστικές ενδονουκλεάσες.
Βήμα 3: Επιλογή κατάλληλου φορέα και άνοιγμα του DNA του φορέα χρησιμοποιώντας τις ίδιες περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Τα βακτηριακά πλασμίδια χρησιμοποιούνται συνήθως ως φορείς για τη μεταφορά ξένου DNA. Τα πλασμίδια είναι μικροί κύκλοι DNA που βρίσκονται μέσα στα βακτήρια.
Βήμα 4: Συνδυασμός του DNA του φορέα και του τεμαχισμένου DNA για την παραγωγή ανασυνδυασμένου μορίου DNA. Αυτό το βήμα διέπεται από λιγάση DNA.
Βήμα 5: Μεταφορά μορίων ανασυνδυασμένου DNA σε βακτήρια-ξενιστές. Αυτό το βήμα είναι γνωστό ως μετασχηματισμός και γίνεται με θερμικό σοκ.
Βήμα 5: Διαλογή μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων σε μέσο καλλιέργειας. Ένας μικτός πληθυσμός μετασχηματισμένων και μη μετασχηματισμένων κυττάρων ξενιστών λαμβάνεται στο τέλος της διαδικασίας μετασχηματισμού. Ως γονίδιο ενδιαφέροντος περιλαμβάνει μόνο μετασχηματισμένα κύτταρα ξενιστές. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να επιλέξετε μετασχηματισμένα κύτταρα. Η επιλογή γίνεται με τη χρήση επιλεκτικών μέσων που περιέχουν αντιβιοτικά. Μόνο τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύσσονται σε αυτό το μέσο διαλογής επιτρέποντας την επιλογή.
Βήμα 6: Ανάπτυξη βακτηρίων για την παραγωγή μιας βιβλιοθήκης γονιδίων. Σε αυτό το στάδιο, τα μετασχηματισμένα κύτταρα ξενιστές εισάγονται σε φρέσκο μέσο καλλιέργειας που παρέχει βέλτιστες απαιτήσεις ανάπτυξης. Οι συνολικές αποικίες στις πλάκες καλλιέργειας αντιπροσωπεύουν τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη αυτού του οργανισμού.
Βήμα 7: Το μόριο ανασυνδυασμένου DNA που περιέχει το γονίδιο ενδιαφέροντος πρέπει να υποβληθεί σε διαλογή από χιλιάδες κλωνοποιημένα θραύσματα ανασυνδυασμένου DNA. Μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση ανιχνευτών που επισημαίνουν το συγκεκριμένο γονίδιο ή τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης από αυτό το γονίδιο.
Μόλις αναγνωριστεί το ενδιαφερόμενο γονίδιο που περιέχει τη βακτηριακή αποικία από τις συνολικές αποικίες, είναι δυνατό να δημιουργηθούν εκατομμύρια αντίγραφα του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που περιέχει το γονίδιο.
Η κλωνοποίηση γονιδίων χρησιμοποιείται για τη δημιουργία βιβλιοθηκών γονιδίων, την παραγωγή ειδικών πρωτεϊνών, βιταμινών, αντιβιοτικών, ορμονών, αλληλουχίας και χαρτογράφησης γονιδιωμάτων των οργανισμών, δημιουργία πολλαπλών αντιγράφων DNA ατόμων στην εγκληματολογία κ.λπ.
Εικόνα_1: Κλωνοποίηση γονιδίων
Τι είναι η PCR;
Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) είναι μια τεχνική που δημιουργεί μεγάλο αριθμό αντιγράφων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA. Η εκθετική ενίσχυση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA λαμβάνεται με PCR υπό συνθήκες in vitro. Αυτή η τεχνική είναι ένα πολύ ισχυρό εργαλείο στη Μοριακή Βιολογία, καθώς μπορεί να πολλαπλασιάσει ένα μικρό δείγμα DNA σε μια χρησιμοποιήσιμη ποσότητα. Η PCR εισήχθη από τον Kary Mullis το 1983 και αυτή η βραβευμένη εφεύρεση δημιούργησε μια τεράστια πρόοδο στη Μοριακή Βιολογία.
Η τεχνική
PCR ακολουθεί επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις PCR όπως φαίνεται στο Σχήμα 02. Μία αντίδραση PCR αποτελείται από τρία κύρια στάδια που λαμβάνουν χώρα σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. μετουσίωση δίκλωνου στο DNA στους 94 0C, ανόπτηση εκκινητών στους 68 0C και επιμήκυνση κλώνου στους 72 0 C. Επομένως, όταν εκτελείται PCR, η διακύμανση της θερμοκρασίας θα πρέπει να διατηρείται σε μεγάλο βαθμό για σωστή αναπαραγωγή. Η PCR πραγματοποιείται σε μηχανή PCR μέσα σε σωλήνες PCR. Οι σωλήνες PCR φορτώνονται με σωστά μίγματα PCR που περιέχουν DNA εκμαγείου, πολυμεράση Taq, εκκινητές, dNTP και ρυθμιστικό διάλυμα. Η μετουσίωση του δίκλωνου δείγματος DNA σε μονόκλωνο DNA γίνεται με σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων στους 94 – 98 0C. Στη συνέχεια εκτίθενται μεμονωμένοι κλώνοι μήτρας DNA για εκκινητές. Θα πρέπει να παρέχεται ένα ζεύγος ασταριών (εμπρός και όπισθεν) και θα πρέπει να είναι θερμοσταθερά για να ανέχονται υψηλές θερμοκρασίες. Οι εκκινητές είναι μονόκλωνες κοντές αλληλουχίες DNA συμπληρωματικές προς τα άκρα του θραύσματος DNA στόχου. Συνθετικοί εκκινητές χρησιμοποιούνται στην PCR. Οι εκκινητές συνδέονται με τις συμπληρωματικές βάσεις του δείγματος DNA και ξεκινούν τη σύνθεση ενός νέου κλώνου. Αυτό το στάδιο καταλύεται από ένα ένζυμο που ονομάζεται πολυμεράση Taq. ένα θερμοσταθερό ένζυμο πολυμεράσης DNA που απομονώθηκε από Thermus auqaticus. Όταν είναι διαθέσιμα εκκινητές και νουκλεοτίδια (δομικά στοιχεία), η πολυμεράση Taq κατασκευάζει τον νέο κλώνο DNA που είναι συμπληρωματικός προς το πρότυπο DNA. Στο τέλος του προγράμματος PCR, παρατηρείται ενισχυμένο θραύσμα DNA χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης. Εάν απαιτείται περαιτέρω ανάλυση, το προϊόν PCR καθαρίζεται από το πήκτωμα.
Η PCR είναι πολύ χρήσιμη για τη διάγνωση και την παρακολούθηση γενετικών και επίκτητων ασθενειών, την ταυτοποίηση εγκληματιών (στον τομέα της εγκληματολογίας), τη μελέτη της δομής και της λειτουργίας ενός στοχευμένου τμήματος DNA, την αλληλούχιση και τη χαρτογράφηση γονιδιωμάτων οργανισμών, κ.λπ. Η PCR έχει γίνει μια συνηθισμένη εργαστηριακή τεχνική σε ερευνητικά εργαστήρια ιατρικής και μοριακής βιολογίας μεταξύ των επιστημόνων, καθώς έχει μεγάλη ποικιλία εφαρμογών.
Εικόνα_2: Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Γονιδιακής Κλωνοποίησης και PCR;
Γονιδιακή κλωνοποίηση εναντίον PCR |
|
| Γονιδιακή κλωνοποίηση είναι η διαδικασία δημιουργίας πολλαπλών αντιγράφων ενός συγκεκριμένου γονιδίου in vivo μέσω ανασυνδυασμένου DNA και μετασχηματισμού σε βακτήριο ξενιστή. | Η τεχνική PCR παράγει πολλαπλά αντίγραφα μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA in vitro μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων αντιδράσεων PCR. |
| Απαίτηση κατασκευής ανασυνδυασμένου DNA | |
| Ανασυνδυασμένο DNA παράγεται για τον εντοπισμό του γονιδίου. | Δεν παράγεται ανασυνδυασμένο DNA. |
| Ανάγκη εργασίας | |
| Αυτή η διαδικασία είναι εντατικής εργασίας. | Δεν απαιτείται εντατική εργασία. |
| Διαδικασία In vivo ή In vitro | |
| Η κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA είναι in vitro και η ενίσχυση του DNA είναι in vivo. | Η ενίσχυση του DNA γίνεται εντελώς in vitro. |
Σύνοψη – Κλωνοποίηση γονιδίων εναντίον PCR
Η κλωνοποίηση γονιδίου και η PCR είναι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση του DNA. Η PCR είναι μια in vitro διαδικασία που δημιουργεί πολλαπλά αντίγραφα DNA ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA χωρίς τη χρήση ανασυνδυασμένου DNA και ενός οργανισμού ξενιστή. Η κλωνοποίηση γονιδίων είναι πρωτίστως μια in vivo διεργασία που οδηγεί σε πολλαπλά αντίγραφα ενός ενδιαφερόμενου γονιδίου μέσα στον οργανισμό ξενιστή μέσω κατασκευής ανασυνδυασμένου DNA. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ της γονιδιακής κλωνοποίησης και της PCR.
